第三篇 基因信息的传递 生物化学与分子生物学教研室 朱利娜

基因(gene) DNA RNA 蛋白质 中心法则 The Central Dogma 转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录 中心法则 The Central Dogma

第十一章 DNA的生物合成（复制） DNA Biosynthesis，Replication

复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤(突变)与修复

第一节 复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication

半保留复制(semi-conservative replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 复制的要点： 半保留复制(semi-conservative replication) 高保真性(high fidelity) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)

一、半保留复制的实验依据和意义 半保留复制的概念 DNA生物合成时，母链DNA双螺旋结构解开而成为单链，各自作为模板，按照碱基互补原则，合成与模板互补的子链。这样子代细胞的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的，另一股单链则完全重新合成，两个子细胞的DNA都与亲代DNA碱基序列一致

半保留复制的实验依据

　1958年Messelson和Stahl的实验

C A T G A G T C A G T C A G T C + 母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA

半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

二、双向复制 复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 复制叉（replication fork）指的是DNA双链解开分成两股，各自作为模板，子链沿模板延长所形成的Y形结构

C. 复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter)

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。

5’ 3’ ori 5’ 3’ 5’ 3’ 复制子

三、复制的半不连续性 3 5 解链方向 3 岡崎片段 5 5´ 领头链 (leading strand) 3´ 5´ 随从链 (lagging strand) 3´ 5´ 岡崎片段 5

子链的合成只能从5`向3`延伸 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology and Topology of DNA Replication

参与DNA复制的物质 底物：dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP） 模板（template）：解开成单链的DNA母链 引物（primer）：提供3`-OH末端 酶及蛋白质因子 DNA聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶 解链、解旋酶类，单链结合蛋白 引物酶与dnaB蛋白 DNA连接酶

一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

聚合反应的实质 聚合反应的特点 核苷酸与核苷酸之间生成3`,5`-磷酸二酯键而逐一聚合 DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 → 3方向进行 。

二、DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 （DNA-dependent DNA polymerase，DNA-pol） 以dNTP底物 需要模板和引物的存在 催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端; 催化DNA合成的方向是5`→3` 具有5`→3`或3`→5`核酸外切酶活性

（一）原核生物的DNA聚合酶 有三种DNA聚合酶：DNApolⅠ、II、III

由A至R共18个a-螺旋区组成 DNA-pol Ⅰ （109kD） 功能：对复制中的错误进行校读 对复制和修复中出现的空隙进行填补

N 端 DNA-pol Ⅰ C 端 木瓜蛋白酶 小片段（A-F） 大片段（G-R）/Klenow 片段 323个氨基酸 604个氨基酸 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-pol Ⅱ（120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 在pol I和pol III缺失情况下暂时起作用 参与DNA损伤的应急状态修复。

DNA-pol Ⅲ (250kD) 10种亚基组成的 不对称异源二聚体 功能： 原核生物复制延长中真正起催化作用的酶

DNA-pol III的亚基的功能 、、：组成核心酶，兼有5   聚合活性和  5外切酶活性 ：复制保真性所必需 ：夹稳模板链并使酶沿模板滑动 -复合物：其余亚基的统称，有促进全酶组装至模板上，以及增强核心酶活性的作用

:能辨认错配的碱基对，并将其水解 :能切除突变的 DNA片段 核酸外切酶活性

(二)真核生物的DNA聚合酶 已至少发现5种：DNA-pol α,β,γ,δ,ε DNA-pol α：起始引发，有引物酶活性

(二)真核生物的DNA聚合酶

三、复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性与校读 （二）复制的保真性和碱基选择

（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基； 并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。

（二）复制的保真性和碱基选择 • DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。

四、复制中解链和DNA分子的拓扑学变化 解螺旋酶（helicase） 引物酶（primase） 单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase） 解开、理顺DNA链，维持DNA在一段时间内处于单链状态

（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白

解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成

DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 作用特点： 松弛超螺旋和双股螺旋，既能水解又能连接磷酸二酯键 分类 拓扑异构酶I型 拓扑异构酶II型

作用机制 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 拓扑 异构酶Ⅰ 反应不需ATP。 拓扑 异构酶Ⅰ 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。 拓扑 异构酶Ⅱ

II

五、DNA连接酶 催化一个DNA片段的3`-OH末端和相邻DNA片段的5`-P末端生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链 需要消耗ATP 只能连接互补链中的单链缺口 在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口的作用

+ 5` 3` P OH DNA连接酶 ATP ADP 3`HO O－P－O－ O O－ 5` 3`HO P 5` DNA连接酶 ATP

三种酶催化生成磷酸二酯键的比较 提供核糖3`-OH 提供5`-P 结果 聚合酶 引物或延长中的新链 游离dNTP去PPi (dNMP)n+1 连接酶 复制中不连续的两条单链 不连续→连续 拓扑酶 切断、整理后的两条链 改变拓扑状态

第三节 DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication

一、原核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始 DNA解成单链，提供模板 形成引发体及合成引物 提供3`-OH末端

1. DNA解成单链 复制有固定的起始点，称为oriC oriC的跨度为245 bp，有特定的碱基顺序 3组串联重复序列——识别区 2对反向重复序列——AT rich区（容易解链） 解链过程主要由DnaA、B、C三种蛋白质共同参与 DnaA：四聚体蛋白，辨认并结合于反向重复序列 DnaB：解螺旋酶；DnaC：协同DnaB蛋白 SSB在一定时间内使复制叉保持适当长度

E.coli复制起始点 oriC 5 3 3 5 串联重复序列 反向重复序列 1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 5 3 3 5 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列 E.coli复制起始点 oriC

2.引发体和引物 复制过程需要引物 —— 短链RNA 解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始复制区域形成引发体。 在适当位置上，引物酶依据模板的碱基序列， 从5`  3` 方向催化NTP聚合，生成短链RNA引物 DNA-pol Ⅲ催化下，引物的3`-OH末端与新链的第一个dNTP形成磷酸二酯键，开始复制 拓扑异构酶：松弛螺旋。

参与复制起始的各种物质 名称 功能 DnaA蛋白 辨认起始点 解螺旋酶(DnaB蛋白) 解开DNA双链 DnaC蛋白 协助解螺旋酶 名称 功能 DnaA蛋白 辨认起始点 解螺旋酶(DnaB蛋白) 解开DNA双链 DnaC蛋白 协助解螺旋酶 引物酶(DnaG蛋白) 催化RNA引物生成 SSB 稳定解开的单链 拓扑异构酶 理顺DNA链 oriC(245bp的DNA组分) E.coli的复制起始点

（二）复制的延长 指在DNA-pol的催化下，以母代单链DNA为模板，按照碱基互补原则，dNTP以dNMP的方式逐个加入而延长子代DNA新链，其化学反应的本质是生成磷酸二酯键。

同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长 DNA-pol III的核心酶和b亚基 同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长

复制过程中各种酶和蛋白质因子的作用 III DNA聚合酶I

复 制 过 程

（三）复制的终止 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 ori ter E.coli SV40 82 32 SV40 50

随从链上不连续性片段的连接 5 RNA酶（水解引物） 5 催化冈崎片段继续 dNTP 延长填补引物缺口 DNA-pol I 5 ATP OH P DNA-pol I dNTP 催化冈崎片段继续 延长填补引物缺口 5 P ATP ADP+Pi DNA连接酶 将相邻的两个DNA片段连接起来，形成完整的DNA链 5

二、真核生物的DNA生物合成 G2 S G1 哺乳动物的细胞周期 M DNA合成期 • 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。 • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

（一）复制的起始 • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）和pol δ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 • 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。

（二）复制的延长 3 5 亲代DNA 领头链 5 3 5 3 随从链 3 引物 5 核小体

单链DNA结合蛋白称之复制蛋白A（replication protein A, RPA）结合到暴露的单链上 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ,PCNA）是DNA聚合酶δ的辅助蛋白质，包含在引物的识别复合物中

切除引物的两种机制 側翼内切核酸酶（flap endonuclease 1,FEN1） 核酸酶H（RNaseH）和側翼内切核酸酶（flap endonuclease 1,FEN1）参与去除RNA引物的作用。核酸酶H降解RNA引物，留下一个核苷酸连在冈崎片段的末端,由FEN1完成去除最后一个核苷酸。 切除引物的两种机制

（三）复制的终止 DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接 染色体两端DNA子链上最后合成的RNA引物，去除后留下空隙。

5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 端粒(telomere) 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 结构特点 • 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是富含G、T短序列的多次重复 TTTTGGGGTTTTGGGG… 功能 • 维持染色体的稳定性 • 维持DNA复制的完整性

端粒酶(telomerase) 组成 端粒酶RNA 端粒酶协同蛋白 端粒酶逆转录酶 提供RNA模板 功能 催化逆转录 (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 提供RNA模板 催化逆转录 功能

端粒酶的催化延长作用 爬行模型 母链反折，有利于下游复制延伸

母链延长至一定长度后，端粒酶脱离母链，母链以其3`-OH反折，同时起引物和模板的作用 DNA聚合酶完成末端双链的复制

Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways

一、逆转录病毒与逆转录酶 逆转录（reverse transcription）： 逆转录酶：又称依赖RNA的DNA聚合酶 （RNA-dependent DNA polymerase） 以RNA为模板的dNTP聚合活性 以DNA为模板的dNTP聚合活性 RNase 活性

病毒RNA 逆转录 RNA-DNA杂交链 RNA链分解 单链DNA DNA复制 双链DNA 逆转录过程

二、逆转录研究的意义 传统中心法则的挑战 拓宽了病毒致癌理论 重要的工具酶 ——获取目的基因的重要方法之一

三、滚环复制和D环复制 滚环复制(rolling circle replication) 是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。

A蛋白 打开缺口 3-OH 5-P 5'  5 3 5 3 5' 滚环复制

D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。 D环复制的特点是复制起点不在双链DNA同一位点，内、外环复制时有时序差别 dNTP DNA-pol γ

DNA Damage (Mutation) and Repair 第五节 DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair

遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。

一、突变的意义 （一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素 1. 物理因素：紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射 UV

2. 化学因素

三、突变的分子改变类型 错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift)

（一）错配 DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换

正常成人Hb (HbA)β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 CTC GAG 基因 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链 CAC GTG 基因

（二）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变 。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失引起框移突变 正常 缺失C 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 谷 酪 蛋 丝 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 正常 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 缺失C

（三）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型

四、DNA损伤的修复 修复(repairing) 修复的主要类型 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复 切除修复 重组修复 SOS修复

（一）光修复(light repairing) UV 光修复酶(photolyase)

（二）切除修复 (excision repairing) 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 UvrA UvrB UvrC 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 OH P DNA聚合酶Ⅰ OH P E.coli的切除修复机制 DNA连接酶 ATP

（四）SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。

思 考 题 原核生物与真核生物中的DNA聚合酶有哪些种类，它们各自的功能是什么?  DNA复制的精确性是通过怎样的机制实现的? 思 　　考 　　题 原核生物与真核生物中的DNA聚合酶有哪些种类，它们各自的功能是什么?  DNA复制的精确性是通过怎样的机制实现的? DNA复制时前导链与随从链的合成有哪些不同？ DNA拓扑异构酶的作用如何? 哪些因素能引起DNA损伤，损伤的哪些类型，生物体是如何修复的? 什么是逆转录，有什么生物学意义? 比较逆转录酶与真核DNA聚合酶的性质。

名词解释 半保留复制 半不连续复制 领头链 随从链 冈崎片段 点突变