第八章 分光光度法 Spectrophotometry 8.1 概述 8.2 光度分析法的设计 8.3 光度分析法的误差 8.4 分光光度法的应用

8.1 概述 1 分光光度法的特点 2 光的基本性质 3 物质对光的选择吸收

一. 分光光度法的特点 定义：分吸光光度法是基于物质对光的选择吸收而建立起来的分析方法。包括比色法、可见及紫外分光光度法及红外光谱法等。我们重点讨论可见光区的分光光度法（又称分光光度法），其测定对象以金属离子为主。 分光光度法属于仪器分析法，与化学分析法相比，主要有以下特点： （1）灵敏度高。可用于微量组分（1℅~10-3℅）和痕量组分的测定（10-4℅~10-5℅） （2）仪器设备简单，操作简便。 （3）准确度较高。一般相对误差为2℅~5℅。 （4）应用广泛。该法不仅可测定绝大多数无机阴离子，也可测定许多有机物；不仅可用于定量分析，也可用于某些有机物的定性分析，还可用于某些物理化学常数及络合物组成的测定。

二. 光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。根据波长或频率排列，得到如表8-1所示的电磁波谱表。

* 单色光（monochromatic light）：具同一波长的光。 * 复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。 * 紫外光（ultraviolet light）：波长200~400 nm。 * 可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的 * 波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。 * 互补色光（complementary color light）：按一定比例混合，得到白光（white light）。 * 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。

三. 物质对光的选择吸收 1. 物质对光产生选择吸收的原因 物质分子内部具有一系列不连续的特征能级，包括电子能级、振动能级和转动能级。在一般情况下，分子都处于能量最低的基态。当用一束连续光照射某物质时，若光的能量恰与分子的某一能级能量差相等，则分子会吸收光的能量从基态跃迁到激发态。由于不同物质的分子结构不同，对光的吸收具有选择性，因而产生其特征的吸收光谱。 2. 物质的颜色与光吸收的关系 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的，物质呈现出的颜色是它所吸收的光的互补色。

3. 吸收曲线（吸收光谱） * 吸收光谱曲线或光吸收曲线（absorption curve）：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标作图。吸收曲线能准确地描述物质对不同波长光的吸收情况。 * 最大吸收波长（maximum absorption wavelengh ）：光吸收程度最大处的波长，用λmax表示 * 吸光度（absorbance）：表示物质对光的吸收程度的大小，用A表示。 吸收曲线的形状和λmax位置取决于物质的分子结构，不同物质因分子结构不同而具有各自特征的吸收曲线，据此可进行物质的定性分析。在同一波长下吸光度随着浓度的增大而增大，据此可进行物质的定量分析。 图8.1是KMnO4溶液的吸收曲线。在可见光区，KMnO4溶液对波长525nm附近绿色光的吸收最强，而对紫色和红色的吸收很弱。λmax=525 nm。浓度不同时，光吸收曲线形状相同，λmax位置不变。

8.2 光吸收的基本定律 1 朗伯-比尔定律 2 标准曲线及其对朗伯-比尔定律的偏离

一.朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)定律 朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)定律分别于1760和1852年研究了光的吸收与溶液的厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。

1.朗伯-比尔定律的意义 当一束强度为I0 的平行单色光垂直照射到长度为b 的液层、浓度为c 的溶液时，由于溶液中吸光质点(分子或离子)的吸收，通过溶液后光的强度减弱为I： 透过光强度I与人射光强度Io之比称为透射比或透光度，用T 表示.溶液的透射比愈大，表示它对光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它对光的吸收愈大。

* 朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分析的理论基础。比例常数K 与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。 * 含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。

2.吸收系数和桑德尔(Sandell)灵敏度 （1）吸收系数 *吸收系数a 当浓度c用g·L-1，液层厚度b用cm为单位表示时，则K用a来表示称为吸收系数，单位为L·g-1·cm-1，它表示物质的量浓度为l g·L-1，液层厚度为lcm时溶液的吸光度。 A=abc * 摩尔吸收系数 molar absorptivity 当浓度c 用mol·L-1，液层厚度b 用cm为单位表示，则K 用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为L·mol-l·m-1，它表示物质的量浓度为l mol·L-1，液层厚度为l cm时溶液的吸光度。

两种吸收系数之间的关系为：ε=aM （2）桑德尔(Sandell)灵敏度S 桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) 用S来表示。S是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2，S 与ε及吸光物质摩尔质量M的关系为： ε越大。S越小，则测定方法的灵敏度越高。

二、标准曲线及其对朗伯-比尔定律的偏离 1.标准曲线的绘制 据光的吸收定律:吸光度A与吸光物质的浓度c成正比，这是光度法进行定量的基础，标准曲线就是根据这一原理制作的。具体方法为:（1）配制一系列不同浓度的标准溶液；（2）在选择的实验条件下，分别测量各标准溶液的吸光度；（3）以标准溶液中待测组分的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作A-c曲线，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。此时测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。

有时标准曲线不通过原点。可能是由于参比溶液选择不当，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。若有色络合物的解离度较大，特别是当溶液中还有其他络合剂时，常便被测物质在低浓度时显色不完全。找出原因，加以避免。

2.引起偏离朗伯-比尔定律的因素 在分光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，如图8.3，标准曲线有时向浓度轴弯曲（负偏离），有时向吸光度轴弯曲（正偏离），这种现象称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。偏离朗伯－比尔定律的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯-比尔定律所要求的理想条件不一致。 （1）非单色光引起的偏离 朗伯-比尔定律只适用于单色光，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯－比尔定律的偏离。

克服非单色光引起的偏离的措施是使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的“单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围；入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多；测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。 （2）非平行入射光引起的偏离 朗伯-比尔定律要求采用平行光垂直入射。若入射光为非平行光，就不能保证入射光全部垂直通过吸收池，可能导致平均光程大于吸收池厚度，实际测得的吸光度将大于理论值，引起正偏离。

（3）介质不均匀引起的偏离 　　　朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲，引起正偏离，故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。 （4）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 　 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。

A 解离 大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱)解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。 B 络合 显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)２＋颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。 C 缔合 例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。 　 在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯－比尔定律的偏离。

8.3分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示的单光束、可见分光光度计（recording spectrophotometer）。 分光光度计的基本部件有光源、单色器、比色皿、检测器和显示装置。如图８.４

1.光源 （light source） 在仪器工作的波长范围内，要求光源能发射足够强度、稳定且波长连续变化的复合光，即要求电源电压保持稳定，通常在仪器内同时配有电源稳压器。在可见光区一般用6~12 V钨丝灯作为光源，其发出的连续光谱在360~800 nm 范围内。在紫外光区，用氢灯或氘灯为光源，它们能发射出185~375 nm范围的光。 2.单色器（monochromator） 单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅。 棱镜（prism）：根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝（slit）照射到吸收池

　上。由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。 光栅（grating）是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。 3.比色皿（coloritrough） 比色皿也称吸收池。用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。

4.检测器（detector） 检测器是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量的。分为光电管和光电倍增管。 光电管（phototube）：一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625~1000 nm;紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200~625 nm。 光电倍增管（photomultiplier）：由光电管改进而成的，管中有若千个称为倍增极的附加电极。可使光激发的电流得以放大，一个光子约产生106~107个电子。它的灵敏度比光电管高200多倍。适用波长范围为160~700 nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。

５.显示装置 显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透射比T的光度分析法的设计方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。

8.4 分光光度法分析条件的选择 1 显色反应（color reaction）及条件选择 2 测量误差及测量条件的选择

一.显色反应（color reaction）及条件选择 １显色反应和显色剂 待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂（color reagent） 2.显色条件的选择 （1）显色剂的用量 　　M(被测组分)+R(显色剂) =MR(有色络合物) 　　　为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。

如图8.5所示，（a）是最常见的情况，应在平坦区选择适当浓度进行测量；（b）也应选择在平坦区；（c）不出现平坦区，一般最好不采用这样的显色体系。

（2）溶液的酸度 M+HR===MR+H+ 溶液的酸度对显色反应的影响表现在三个方面： 　A.显色剂的平衡浓度和颜色 　B.影响被测金属离子的存在状态 　C.影响络合物的组成 　在实际测定中，常常 　通过绘制pH与吸光度 　关系曲线确定适宜的 　pH范围。

（3）显色反应时间 　有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。 （4）显色反应温度 　　　显色反应大多在室温下进行。但是有些显色反应必需加热至一定温度完成。 （5）溶剂 　　　有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。

（6）干扰及其消除方法 　　　试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。 　　　为消除以上原因引起的干扰，可采取以下几种方法。 a. 控制溶液酸度 b.加入掩蔽剂 选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。 c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d.利用校正系数 e.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。 f.选择适当的波长 g.当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。 h.分离 以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。

例 丁二酮肟光度法测钢中镍， 络合物丁二酮肟镍的最大吸收 波长为470 nm，但试样中的铁 用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm 处也有一定吸收，干扰镍的测 定。为避免铁的干扰，可以选 择波长 520 nm进行测定，虽然 测镍的灵敏度有所降低，但酒 石酸铁不干扰镍的测定。

测量误差及测量条件的选择 1. 吸光度的测量和测量误差 a.调节检测器零点，即仪器的机械零点，即检流计上T=0或A=∞的端点。 b.用参比溶液调节吸光度零点，又称工作零点，即检流计上T=100%或A=0的那一点。 c.待测组分吸光度的测定：调好检测器零点和吸光度零点后，就等于确定了检测器T标尺的两个端点，此时把待测溶液推入光路，可直接读出其相应的T或A值。

在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。 透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。

2. 测量条件的选择 （１）测量波长的选择 　　　为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”（maximum absorption）。选用这种波长的光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。但是，在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应根据入射光波长。 （2）吸光度范围的选择 　　 从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.2~0.8范围内。可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池来达到目的。

(3) 参比溶液的选择 　　 利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择： a 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。 b 显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 c 显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。 d 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。

e 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。

例 丁二酮肟光度法测钢中镍， 络合物丁二酮肟镍的最大吸收 波长为470 nm，但试样中的铁 用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm 处也有一定吸收，干扰镍的测 定。为避免铁的干扰，可以选 择波长 520 nm进行测定，虽然 测镍的灵敏度有所降低，但酒 石酸铁不干扰镍的测定。

8.5 分光光度法的应用 1 示差分光光度法 2 双波长分光光度法 弱酸和弱碱解离常数的测定 络合物组成的测定

一、 示差吸光光度法（differential） 1 示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低，会引起很大的测量误差，导致准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。它们的基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。

吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为ΔA 和Δc 的标准曲线，根据测得的ΔA 求出相应的Δc 值，从cx=co+c 可求出待测试液的浓度，这就是示差分光光度法定量的基本原理。

2 示差吸光光度法的误差 Δc (即cx－co)，测量误差为x%， 结果为cx±(cx-co)×x%； 普通光度法的结果为cx±cx·x%。因cx只是稍大于co，故cx总是远大于Δc，故示差吸光光度法的准确度高。参比溶液的浓度越接近待测试液的浓度，测量误差越小，最小误差可达0.3%。

二、 双波长分光光度法 （dual-wavelength） 1 双波长分光光度法的原理 使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度高。被广泛用于环境试样及生物试样的分析。

ΔA与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依 据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光 的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸 收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。

2 双波长吸光光度法的应用 * 混浊试液中组分测定 ：一般选择待测组分的最大吸收波长为测量波长(λl)，选择与其相近而两波长相差在40~60 nm范围内且有较大的ΔA 值的波长为参比波长。 * 单组分的测定 ：进行单组分的测定，以络合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长; 以有色络合物吸收曲线下端的某一波长作为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。

* 两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是:待测组分在两波长处的吸光度之差ΔA要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关系，与干扰组分无关，从而消除了干扰。

测定苯酚(X)与2，4，6-三氯苯酚(Y)混合物中的苯酚时就可用这种方法。当选择λ2为测量波长，三氯苯酚在此波长处也有较大吸收，产生干扰。选择波长λ1或λ1‘（等吸收点）作为参比波长，则可以消除三氯苯酚对苯酚测定的干扰。

三、 弱酸和弱碱解离常数的测定 如果有机弱酸或弱碱在紫外-可见光区有吸收，切其吸收光谱与其共轭碱或酸显著不同时，就可以利用分光光度法测定它的解离常数。 如HB==H++B- 配制三种分析浓度相同而不同的溶液。第一种溶液的pH≈pKa，此时[HB]和[B-]共存，测其吸光度为A；第二种溶液pH≤pKa －2，此时弱酸几乎全部以[HB]型体存在，测其吸光度为AHB；第三种溶液pH≥pKa ＋2，此时弱酸几乎全部以[B-]型体存在，测其吸光度为AB，则

四、 络合物组成的测定 固定一种组分(通常是金 1 饱和法(又称摩尔比法) 属离子M)的浓度，改变络合 剂(R)的浓度，得到一系列 1 饱和法(又称摩尔比法) 固定一种组分(通常是金 属离子M)的浓度，改变络合 剂(R)的浓度，得到一系列 [R]/[M]比值不同的溶液， 并配制相应的试剂空白作 参比液，分别测定其吸光度。 以吸光度A为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。

cM+cR=c，改变cM和cR的相对量， 2 等摩尔连续变化法(又称等摩尔系列法) cM+cR=c，改变cM和cR的相对量， 配制一系列溶液，在有色络合物 的最大吸收波长处测量这一系列 溶液的吸光度。当溶液中络合物 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。 当cM/c为0.5时，络合比为1:1； 当cM/c为0.33，络合比为1:2； 当cM/c=0.25时，络合比为1:3。

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