第五章 STR自动分型 (STR automatic typing)

国际上通用的法医STR分型 Allele PCR product

聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis) (Agarose gel electrophoresis)

Examples of DNA in the News 2004 Indian Ocean Tsunami 2001 “911”, New York 2008 Wenchuan Earthquake

STR自动化分型的优势 扩增片段多在400bp以下，适合法医生物检材的特点； STR在人类基因组(genome)中分布广泛、多态性好； 扩增效率高，阳性检出率大；突变率低; 基因频率(Gene frequency )分布比较平均 基因座杂合度(heterozygosity)>0.8 个人识别能力(Personal identification)>0.9 易于实现DNA分型的自动化、标准化和信息化； 快速、灵敏、准确、稳定、重复性好 易于实现实验室间的比对

PCR-STR DNA提取 (DNA extraction) 银染 PCR扩增 PAGE CE 荧光染料 (Silver stain) PCR (amplification) PAGE CE 荧光染料 (fluorochrome)

256 data points in 45 minutes with STR 16plex and 16 capillaries High-Throughput STR Typing on the ABI 3100 (16-capillary array) 256 data points in 45 minutes with STR 16plex and 16 capillaries

第一节 荧光标记STR复合扩增 (Fluorescent tags STR composite amplification)

常用的复合扩增方法有2种： 银染系统 (Silver stain) 荧光标记STR自动检测系统 (Fluorescent tags STR automatic detection system )

Methods for Parallel Sample Processing Multiplex by Size Blue Green Yellow Combined Internal sizing standard in red Multiplex by Dye Color Multiplex by Number of Capillaries

方法 单基因座扩增 多基因座复合扩增 (Single gene amplification) 荧光毛细管 银染检测 电泳检测 荧光 复合 (Composite amplification multiple ) 荧光 复合 扩增 毛细 管电 泳 单基因座扩增 (Single gene amplification) 荧光毛细管 电泳检测 银染检测

(Laser induced fluorescence dye with automatic analysis) 激光诱导荧光染料显带自动分析 (Laser induced fluorescence dye with automatic analysis) 荧光染料标记在每个基因座中一条引物的5’端，不同基因座引物标记不同的荧光标识物。经过扩增后的等位基因产物均携有荧光，电泳分离长度等位基因，用荧光扫描系统对凝胶检测。按照荧光的颜色区别基因座，根据片段的迁移率确定片段长度等位基因。

各基因座等位基因根据片段的电泳位置及荧光颜色而区分 引物的5’端标记 扩增片段不重叠的基因座使用相同的荧光标记物 扩增片段重叠的基因座使用不同的荧光标记物 各基因座等位基因根据片段的电泳位置及荧光颜色而区分

商品化试剂盒(Commercial kits) 数据库建设、实验室间比对 自行设计STR基因座组合

关键点和难点 引物(primers)的选择 荧光染料标记 复合扩增条件的优化

核心重复序列(Core repetitive sequence )规律 片段大小符合法医学应用 引物的退火温度相似 引物选择 多态性好 核心重复序列(Core repetitive sequence )规律 片段大小符合法医学应用 引物的退火温度相似

6-FAM VIC NED PET

荧光染料选择的原则 片段大小相同的基因座标记不同种类的荧光， 片段大小不同的基因座标记同一种荧光 同一种荧光标记的基因座等位基因之间相差在 10bp以上,差值不应为4的整倍数 组合荧光染料的发射波长相差越大越好， 通常20-30nm

法医DNA实验室常用的STR复合扩增系统 4色或者5色荧光标记 分子量内标DNA片段（ROX或LIZ） 余下的3 or 4种标记STR基因座 ——1-6个STR/种

复合扩增条件的优化 引物(primes)浓度以及引物之间的混合比例 退火温度(Annealing Temperature)的选择 延伸温度(Stretching temperature )和循环(cycle)的 时间 镁离子(Mg2+)以及dNTP的浓度

单基因座扩增的条件 变性 预变性(Initial denaturation) 95˚C,45s 97℃,5min 35 退火(annealing) 59˚C, 45s 延伸(stretch) 72˚C, 45s 60℃, 60min

ABI ID试剂盒的扩增条件 预变性 95℃,11min 变性 95˚C,1min 35 退火 延伸 59˚C, 1min 60℃, 60min

AmpFℓSTR® Identifiler ®试剂盒

Kit component

目前AB公司专门正对中国人群的DNA多态性开发了名为“AmpFℓSTR® SinofilerTM”的试剂盒，用多态性较好的“D12S391”和“D6S1043”取代了“AmpFℓSTR® Identifiler ®”试剂盒中的“TPOX”和“TH01”。

荧光染料分子的大小、形状会改变DNA-染料结合物的总体大小。 存在于荧光染料上的离子电荷，会改变结合物的电荷质量比。 荧光染料会影响STR等位基因的电泳迁移率(Electrophoretic mobility )。

等位基因分型标准（Ladder）： 需要标记同样的荧光染料，以消除荧光染料对迁移率(mobility)的影响。

STR自动分型 荧光标记复合扩增 毛细管电泳检测 确定等位基因 基因分型图谱数据 高效 灵敏 准确 稳定 重复性好