利用荧光显微技术研究生物单分子 陈浩　200425023 分析化学专业

光学单分子方法的进展 近20 年来, 光学探测方法有了长足的进步。在80 年代出现并逐渐成熟起来的近场显微术为超衍射极限分辨成像提供了基本手段, 同时也使光学显微术进入了纳米科学的领域。而共焦显微术不仅突破传统光学的衍射极限, 而且为光学探测引入了第三维空间信息, 使光学探测具有了层析能力, 实现了真正的空间三维成像。 超短脉冲激光技术直接导致了多光子荧光显微术的成功。尤其是飞秒激光激发的荧光显微术, 对于提取时间分辨的信息是有力的工具。这种荧光单分子探测及单分子光谱探测与其数据处理方法的组合, 形成了荧光共振能量转移的探测方法。通过该方法可以获得1.5 纳米～ 8 纳米的空间分辨率的构像信息, 达到光学方法上最高的分辨率。 以上近场、共焦、荧光显微术和荧光共振能量转移四种基本技术构成了目前活跃的生物单分子探测的光学平台。

Myosin V 的分子结构 肌球蛋白是包含18个不同子类的一大类蛋白分子马达，但构型上都属于二聚体，有两个明显伸出的“头”，用于附着在肌球蛋白丝上，这里我们干脆称之为“腿”。

Myosin V 的两种运动模型 >> (1)在Hand-over-hand模型中，后腿向前移动了74nm，而前腿没有移动。分子本身移动了37nm，染料移动了37±2xnm，(如果MyosinV的结构是不对称的，x为染料到轴的平均距离)。 (2)在inchworm模型中，myosin 分子的所有部份都向前移动37nm，并且有一个头始终与肌球蛋白丝结合在一起。

单分子荧光技术检测运动模型 把一个荧光分子标记在myosin V 的一条腿上，再用荧光显微镜来对标记的荧光分子进行检测。据此来研究myosin V的迈步过程。 具体检测技术： 全内反射荧光显微＋共聚焦荧光显微

远场和近场光学检测 主动或被动发光的原因是物体受激发之后,内部电偶极跃迁引起电磁场的辐射,电磁波从物体表面向自由空间传播。 物体表面以外的场分布可以划分为两个区域: 距物体表面仅几个波长内区域,这一区域称为近场区域; 近场区域以外到无穷远是远场区。 常规激发和收集均处于远场区域。在远场区域只存在可以向无穷远传播的远场波(也称为辐射波) 。近场区域光场包括了限于表面仅几个波长内存在的成分,即近场波(也称为非辐射波) ;又包括远场波。近场波也被称为衰逝波,(隐失波) ,其强度随离开表面距离指数衰减,不能在自由空间存在。近场波体现了光在传播过程中,遇到空间光学性质不连续时,光波的空间瞬态变化,这种变化很快在空间衰减,它反映了空间光学性质的不连续性。

全内反射显微 光在光密介质中传输, 如果它以大于临界角的角度入射到另一个折射率较小的介质上, 光就会发生全反射。。实际上, 即使当角度> Hc, 仍然会有一小部分能量以隐失波的形式穿透到液体介质中, 在“近场”情况下, 光沿平行界面传播。由全内反射产生近场激发照明之后, 利用共焦或宽场去取像, 即构成荧光标记全内反射荧光显微镜。 全内反射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光学层析层切片意味着信噪比比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。其图像是通过CCD 相机来捕获的。这种仪器很灵敏或成像速度很快(但很少有CCD 相机兼有以上两个优点) ,目前可达到的量子产率已到～ 80% , 成像速率～200帧/ 秒。

共聚焦显微 在光学成像系统中利用两个焦点来生成物体的象。一个焦点为使用显微镜物镜把入射的激光在物体表面或内部形成的。这个焦点便是一个象点，也是一个点光源。它可以是反射的光，也可以是物体受激发发出的荧光。这一象点再通过另一个物镜成像在针孔孔径上，则生成了第二个焦点。这两个焦点是共轭的（共焦）。 通过沿x或y方向一点点地生成象点，综合成平面图像，再调节z方向生成象点，通过计算机合成三维图像。 所以共焦显微镜具有对细胞和光漂白区域进行深度三维成像的能力。

Hand-over-hand VS inchworm 纳米精度荧光成像技术FIONA Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy inchworm模型预测每步的长度应该是37nm，分子本身移动也是37nm；而hand-over-hand模型观测长度应该是分子本身移动位移的两倍――也就是74nm。为了测试这两个运动模型，科学家开发了一种单荧光分子成像技术来定位，误差可以小于1.5nm，并具有0.5秒的时间分辨率。　同时可以拍摄几分钟的影像来观察。全内反射荧光显微(TIRF)用来激发多个单个的荧光分子，并使用CCD来拍摄帧逐帧连续图像（不存在帧间的失效时间）。单纳米精确荧光成像(FIONA)技术比使用其它方法在常温下对单荧光分子定位精确度提高了20倍，在成像能力上提高了10倍。 Probes: RB or Cy3

在myosin V的光链区用一个RB或Cy3荧光分子来标记。被标记的myosin V分子被加到肌动蛋白丝，并用TIRF来观察。 荧光图像使用0.5s的时间来收集。大概每40μm*40μm的区域内有20个点可以被观察到。每个FWHM 280nm，大约每个光斑在每张照片上有5000到10000个光子被收集到，这使我们能够对中心区进行定位，偏差小于±3nm，比较亮的点，偏差小于±1.5nm。有些染料的闪烁导致的亮度变化可以被观察到。

如何检测单分子 生物单分子的尺度在1 纳米～10 纳米, 目前荧光标记的单分子团在100 纳米左右。传统光学方法(远场显微镜) 达到的最好分辨率是250 纳米, 共焦显微镜的分辨率仅提高了1. 4倍～ 2 倍, 荧光显微术可以再提高2 倍～ 4 倍, 但是仍不能达到单分子级。因此目前利用荧光远场成像方法所揭示的大部分是荧光团的行为。 在分析了大量图像之后，发现大多数光斑都显示单个的熄灭，表示这是单个的分子。测出的步距只是单个被标记的myosin分子的。

在没有ATP存在时，荧光光斑不移动。加入≈300nm ATP之后可识别到有移动，且ATP浓度越大，平均移动率越高。总的说来，我们观察到49个不同的标记上BR的myosin V分子并检测到总共552步。我们观察了三个不同群体的myosin V分子群，显示出几种不同的步长，有74nm的，也是52/23之间变动的，或者42/33之间变动的，但没有发现37nm长的。

Myosin V步距的统计 如果是inchworm模型，每一步的长度应该都是37nm左右。 检测了38个myosin V分子的365步，每一步都是迈出≈74nm。其中32个分子足够亮，可以产生一个大于10的信噪比SNR，在总共231步中。 这些步的柱状图显示平均步距为73.8±5.3nm(5.3nm为平均标准偏差)，这与正态分布有非常好地拟合(r 2=0.994, X2 r=1.67)。同时也检测到了6个按52/23nm交替前进的分子，和6个按42/33交替前进的分子。 如果是inchworm模型，每一步的长度应该都是37nm左右。

结论 myosin V 的运动是遵循hand-over-hand模型的， 两个头部交替附着在肌球蛋白丝上向前运动。 以上是一个完整的利用单分子荧光技术来检测生物 大分子的例子。

Animation: Myosin V walking along an actin filament 电子扫描成像显微术及各类非光学的探针扫描成像显微术均具有比光学显微镜更高的空间分辨能力。但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难。而且它们均不能获得样品重要的光学信息(例如: 光的反射率、折射率、偏振态及光谱等信息) , 特别是不能进行无损伤性生物活体探测, 因而无法完全取代光学显微成像的地位。

荧光共振能量转移 该技术可以从探测到的荧光强度随时间的变化来获得分子之间的距离和方位的信息。它的原理如下: 两个被不同荧光染料标记的分子或细胞的两部分, 当它们相距在10- 100 埃时, 能量开始从给体荧光团传递到受体荧光团, 即产生能量共振现象, 使该受主辐射光子。 探测此能量转换的方法可以利用共焦显微术结合全内反射显微术的方法。

展望 虽然光学方法对于探测单发光团分子是足够灵敏的, 但它不可能局部化这个探测点小到可以与一个分子尺度相比的程度。为了改进分辨率缩小光孔尺寸, 需使本来很弱的光衰减得更弱。最终要求在探测中不仅是探测到单分子荧光团的存在, 而且要探测到单分子的结构形状和行为。解决该问题的途径之一是使光学显微镜的荧光高灵敏探测与原子力显微术相结合。还可以借助于光钳进行单分子操作技术, 并且合并光谱信息的探测。 在增进我们对生物大分子行为及其功能关系的理解方面,单分子荧光探测和光谱给人们以很大的希望。其最大的挑战是掌握研究活细胞中个别的和稀有的生物过程。目前的染料荧光技术还不能完全应付这种挑战。但是对于适用于半导体激光的荧光染料技术的研制已经起步 , 发展其它利用特殊光物理性质的新荧光探针也是必要的。

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