第七章 中药制剂中各类化学 成分分析

以中药饮片为原料药的中药制剂，治疗疾病的物质基础是其中所含的多种化学成分，包括生物碱类、黄酮类、醌类、皂苷类、萜类、挥发油等成分，这些化学成分由于结构特征不同，其理化性质、提取、分离、纯化方法及鉴别和含量测定方法也存在很大差异。为了全面准确评价中药制剂的质量，建立科学、规范、客观、实用、可行的中药制剂质量标准，应熟悉中药中所含主要类型化学成分的结构特征、理化性质、提取分离、鉴别及含量测定方法。

主要内容 生物碱类成分分析 黄酮类成分分析 醌类成分分析 香豆素类成分分析 皂苷类成分分析 萜类及挥发油类成分分析 其他类型成分分析 含动物药、矿物药中药制剂分析

第一节 生物碱类成分的分析 一、概述 生物碱 生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋 白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物。因 第一节 生物碱类成分的分析 一、概述 生物碱 生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋 白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物。因 其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。 分布：较广(高等植物中)，种类较多(上万种); 分布具有不均匀性(植物的器官和组织); 生物活性：高，多方面; 活性成分，毒性成分。

含生物碱成分的常用中药： 黄连、黄柏、川乌、麻黄、延胡索、苦参、贝母、马钱子等。 绝大多数生物碱具有显著的生物活性，有的为中药制剂的活性成分、有的为毒性成分。如小檗碱有抗菌消炎作用；苦参总生物碱有消肿利尿、抗肿瘤、抗病原体作用；麻黄碱有止咳平喘作用；四氢帕马丁具有镇痛作用；乌头碱、士的宁有毒性作用等。因此中药制剂中含有生物碱时，生物碱成分常作为鉴别、含量测定的依据，如果为毒性成分则作为限量检查的依据，如:乌头中双酯型生物碱的限量检查。

二、结构特征和理化性质 （一）结构特征 组成：C、H、N、O 结构类型： 杂环类 大环类 氮原子的存在形式： 萜类 脂氮、芳氮 甾体类 有机胺类 氮原子的存在形式： 脂氮、芳氮 季胺、叔胺、仲胺及伯胺 游离状态和酸结合状态 氮氧配位键 取代基： 烷烃 羟基 羧基、酚羟基 酯键

（二）理化性质 1. 物理性状 状态：多数为结晶性固体 少数为无定形粉末 还有一些为液体（槟榔碱等） 个别液体及小分子生物碱具有挥发性或升华性 色泽：一般为无色或白色 少数有色（含有较长共轭体系，并有助色团） 旋光性：与生理活性有关，左旋 > 右旋

溶解性 结构特征复杂，溶解性呈现多样化。 游离生物碱: 极性较小 —易溶于CHCl3，Et2O，EtOH等有机溶剂。 生物碱盐: —水溶性增强。 中药制剂中生物碱测定时样品前处理： 应注意结合生物碱成分的不同情况（结构特征、存在状态及溶解性规律）采用相应的提取分离及净化方法。

3. 碱性 碱性强弱的影响因素： 氮原子上孤电子对的杂化方式; 氮原子上电子云密度分布; 分子的空间效应; 分子内是否有氢键形成。 主要反应类型：可与酸成盐。 碱性强，在植物中以盐的形式存在； 碱性较弱，在植物中以游离的形式存在； 盐的类型：单酸度盐、二酸度盐等。 碱性强弱是供试液制备、分析方法建立和条件 选择的基础。

制备生物碱制剂供试品时要根据生物碱的碱性选择相应的提取溶剂。 碱性很弱的生物碱，在植物体内往往以游离状态存在，可用三氯甲烷等有机溶剂提取。 碱性较强的生物碱多与一些植物酸结合以盐的形式存在，所以用三氯甲烷等有机溶剂提取生物碱时，应先将原料药加碱碱化使生物碱游离后提取。

4. 沉淀反应 生物碱 + 试剂 复盐 分子复合物 碘化物的复盐 重金属盐 大分子酸 常用的沉淀剂： 碘-碘化钾，碘化铋钾，碘化汞钾， 酸性水溶液 复盐 分子复合物 生物碱沉淀试剂 碘化物的复盐 重金属盐 大分子酸 常用的沉淀剂： 碘-碘化钾，碘化铋钾，碘化汞钾， 磷钼酸，硅钨酸，磷钨酸，苦味酸, 硫氰酸铬铵，四苯硼钠。 作用：鉴别生物碱； 定量测定生物碱。 干扰(假阳性反应)： 蛋白质、多肽、鞣质。 干扰(假阴性反应) ： 麻黄碱（不与沉淀试剂作用）

5. 显色反应 这两类反应，有一定的化学计量关系， 可用于定量测定。 生物碱 + 浓无机酸为主的试剂 不同的颜色 ——只能用于鉴别。 生物碱 + 酸性染料（磺酸肽类） 有色 配合物 氯仿定 量提取 pH 含酯键的 生物碱 异羟肟酸铁 反应试剂 紫红色 这两类反应，有一定的化学计量关系， 可用于定量测定。

6. 紫外光谱特征 ——结构中的共轭体系 影响特征吸收峰的因素： 共轭体系中的助色团的种类、位置和数量; 氮原子与发色团的相对位置; N - 发色团 (参与共轭体系) λmax与pH有关 如：喹啉在酸性溶液中比在中性溶液中显示 红移现象。 具羟基取代苯结构的生物碱 λmax与pH有关。(碱性红移)  检测波长的选择应考虑溶液pH的影响。

三、定性鉴别 —— 化学反应法和色谱鉴别法 （一）化学反应法——沉淀反应法(供试液须净化) 马钱子散中生物碱成分的鉴别： 处方：马钱子和地龙 马钱子碱 士的宁 蛋白质、多肽 盐 浓氨水 游离 碘化铋钾 黄棕色 (溶于氯仿) (不溶于氯仿) × 氯仿

（二）色谱鉴别法 薄层色谱法（TLC） 纸色谱法（PC） 高效液相色谱法（HPLC）

1.薄层色谱法 吸附剂：硅胶或氧化铝 展开剂：低极性溶剂氯仿、苯等 + 其它溶剂 检测：直接日光观察(有色的生物碱)； UV灯(有荧光的生物碱)； 喷显色剂(改良的碘化铋钾)后观察。 注意：硅胶呈弱酸性，碱性较强的生物碱在板上 容易形成复盐，使Rf值变小或拖尾，形成 复斑。一般在碱性环境下展开。

2.纸色谱法 ——鉴别生物碱盐或游离生物碱  生物碱盐 固定相：水。 展开剂：用极性强的酸性溶剂。 常用BAW体系(正丁醇-醋酸-水), 有时可用盐酸替代醋酸。  游离生物碱 固定相：非水性的亲水性溶剂甲酰胺等。 流动相：用甲酰胺饱和的亲脂性有机溶剂 （苯、氯仿或乙酸乙酯等）。  显色剂：同TLC法，但含硫酸的试剂不能用。

3.高效液相色谱法 （三）应用实例 鉴别的依据：色谱条件恒定时，tR(i)值恒定。 鉴别方法： 条件恒定: tR(i)为常数； 条件不同: 已知对照品作内标物，采用峰面积或 峰高加大法进行检识。 （三）应用实例 例：急支糖浆中麻黄碱的鉴别—TLC法 薄层板：硅胶G 展开剂：CHCl3-甲醇-浓氨水（40:10:1） 显色试剂： 茚三酮

四、含量测定 发展（早期）： 近期： 分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法 酸碱滴定法 气相色谱法 沉淀法 高效毛细管电泳法 发展（早期）： 近期： 分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法 气相色谱法 高效毛细管电泳法 酸碱滴定法 沉淀法 注意：从提取、净化到测定，每一步都要准确。 准确度：回收率（加样回收率）。

（一）总生物碱含量的测定 1.化学法：容量分析法和重量分析法 容量分析法——酸碱滴定法 水溶液 非水溶液 碱性强 剩余量滴定法（回滴） 碱性弱(pKa 2~1)

指示终点的方法：指示剂和各种电位法。 指示剂： 水相：溴酚蓝、甲基红、溴甲酚蓝等。 非水：酚酞、甲基黄、溴酚蓝、结晶紫。 供试品的制备：提取、净化、脱水、过滤等。  净化时若用氧化铝，应选择中性氧化铝 并用空白实验校正结果。

直接重量法：提取后，使其沉淀，干燥，称重。 用于混合碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱 测定。 优点：计算简便，不用换算因数，分子量无影响。 缺点：①挥发性生物碱、遇热不稳定生物碱及碱性 条件下易水解的生物碱不宜。 ②取样量大，易乳化，费时。 重量分析法 生物碱试剂沉淀法 优点：取样量少，灵敏度高。 缺点：计算较复杂；操作繁琐；干扰因素多 （沉淀剂、pH、温度及共存物）。

2. 分光光度法 ——单波长光度法 ① 自身的λmax吸收波长作为测定波长。 ② 加显色试剂（亚硝酸钠、雷氏盐、酸性染料等） 显色后测定。 供试液-分离净化方法： 化学法、柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法

（1）直接测定 ——利用生物碱自身的光吸收直接进行比色测定 药典收录： 左金丸 戊己丸 驻车丸（P164 例） 桂林西瓜霜 香连丸（片）

（2）离子对萃取比色法 生物碱 + 有机溶剂(定量) 酸性染料 磺酸类 酸类阴离子 pH 有色离子对(定量) 比色测定

 酸性染料： 甲基橙 溴麝香草酚蓝（溴百里酚蓝BTB) 溴甲酚绿  无机离子： Cl-, Br-, I-, ClO4-  磺酸类： 甲苯-4-磺酸 萘-2-磺酸  酸类和羧酸类： 苦味酸 苯甲酸 水杨酸

酸性染料比色法（溴百里酚蓝BTB等） B HIn pH In- BH + · In -（有色） pH选择： 依据染料的性质和生物碱的pKa 一般规律： 一元碱和BTB形成1:1的离子对， 5.2＜ pH＜6.4 二元碱和BTB形成1:2的离子对， 3.0＜ pH＜5.8

染料： 甲基橙、溴百里酚蓝（BTB)、 溴甲酚绿、 溴酚蓝、溴甲酚紫 有机溶剂选择： 原则——离子对能与有机溶剂形成氢键及成键能力的强弱; 常用——氯仿、二氯甲烷；（不用CCl4，苯等提取率低。) 注意事项：有机溶剂中的微量水会影响测定结果， 水使有机溶剂发生乳化现象。 排除方法：有机溶剂提取液中加入脱水剂（无水 Na2SO4）或经滤纸过滤除去微量水分。

雷氏盐比色法 雷氏盐：雷氏铵或硫氰酸铬铵 NH4 [ Cr (NH3)2 (SCN)4 ]·H2O 性质：为暗红色的结晶或结晶性粉末，微溶于冷水，易溶于 热水，可溶于乙醇。 定量依据： 雷氏盐在酸性介质中可与生物碱定量生成难溶于水的有色 配合物(沉淀)。 生物碱与雷氏盐反应的沉淀组成与碱性强弱和pH有关： 生物碱中各氮原子碱性都较强时,在酸性较小的溶液中生成 单盐；在酸性较大的溶液中可相应地生成双盐、叁盐等； 碱性较弱的则无论酸性较高还是较低均生成单盐； 季铵类生物碱分子中有几个季铵氮原子，即与几个沉淀剂 分子结合。

测定方法： 生物碱雷氏盐有色沉淀易溶于丙酮，其丙酮溶液所呈现的吸收特征是由于分子结构中硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分。 1. 将此沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇）直接比色测定，换算成生物碱的含量； 2. 也可以精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，用滤液在520～526nm （溶于甲醇时，其λmax 为427nm ）进行比色测定残存的过量雷氏盐含量，间接计算生物碱的含量。

计算方法： 硫氰酸铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数ε=106.5 （单盐），故可根据其吸收值A 按下式直接测定，而不需绘制标准曲线。 m ― 被测物的质量（mg ) M ― 被测物质的分子量 V ― 溶解沉淀所用丙酮的毫升数

注意事项： 雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜 配制，沉淀也需在低温进行。 供试品如为稀的水溶液（如注射剂等），沉淀 前应浓缩。对于中药制剂含有干扰物质时，应 事先经过纯化处理。 雷氏盐的丙酮或丙酮－水溶液的吸收值，随 时间而有所变化，故应尽快地测定。

苦味酸盐比色法(λ=360nm) 生物碱 + 苦味酸 中性或弱酸性 沉淀(定量生成) 氯仿溶后λ=360nm比色 碱性条件下解离释放出游离碱 ＋苦味酸 有机溶剂萃取出出游离的生物碱 苦味酸碱液比色

异羟肟酸铁比色法 含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3+生成紫红色的配合物，在一定浓度下符合Beer 定律，可用比色法进行含量测定。 干扰： 凡含有酯键（包括内酯）结构的成分均能与试剂反应，因此用此法进行定量时，供试品溶液中必须不存在其他酯类成分，否则对测定结果有影响。

应用实例 ——酸性染料比色法 0.1%溴甲酚绿；pH3.0；λ=412nm。 例1 风湿骨痛胶囊中乌头碱总生物碱的含量测定 例1 风湿骨痛胶囊中乌头碱总生物碱的含量测定 ——酸性染料比色法 0.1%溴甲酚绿；pH3.0；λ=412nm。 例2 万氏牛黄清心丸中黄连总季铵碱的测定 ——苦味酸盐比色法(λ=360nm) 例3 产妇康颗粒中益母草总生物碱的含量测定 ——雷氏盐比色法(丙酮介质λ=525nm) 例4 附子注射液中酯型生物碱的含量测定 ——异羟肟酸铁比色法

（二）单体生物碱的含量测定 1.TLCS 选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似，但要求比鉴别严格。如果使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂后才可喷洒，否则背景深，反差小，影响测定。  应用举例: 九分散中士的宁的含量测定——薄层扫描法 浓氨水＋氯仿 续滤液 氯仿供试品液 GF254薄层板 双波长扫描 冷浸24h 稀H2SO4液 氨水碱化 氯仿提取 提取

2.HPLC 液-液分配色谱法 正相 液-固吸附色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 反相 注意事项： 用硅烷化试剂对硅胶进行化学修饰，硅胶表面仍存有游离的硅醇基，不同厂家生产的色谱柱中其游离硅醇基的含量也不同，即使同一厂家，不同批号的固定相填料，其游离硅醇基也不尽相同。由于硅醇基酸性较大，生物碱类成分可与其牢固地键合，从而影响色谱行为，使保留时间延长，峰形变宽，拖尾。为了克服游离硅醇基的影响，可采取以下措施：

(1) 改进流动相 ① 在流动相中加入硅醇基抑制剂，竞争或部分阻断硅醇 基的影响，最常用的硅醇基抑制剂是二乙胺、三乙胺 （TEA）等。 ① 在流动相中加入硅醇基抑制剂，竞争或部分阻断硅醇 基的影响，最常用的硅醇基抑制剂是二乙胺、三乙胺 （TEA）等。 ② 在合适的pH 下，流动相中加入低浓度离子对试剂，可 通过与生物碱类成分生成离子对而掩其碱性基团，使 之不会与固定相表面的硅醇基作用，离子对试剂常 用 辛烷磺酸钠或十二烷基磺酸钠表面活性剂，系统偏 酸 性。采用离子对色谱系统后必须马上清洗柱子，避 免 过夜，以保证色谱柱的寿命。 ③ 也可以在流动相中加入季铵盐试剂掩蔽固定相表面的硅 醇基，例如在水－甲醇流动相中加入0.01 mol/L的溴化 四甲基胺，能在较短的保留时间内得到很好的分离，色 谱峰重现性好，也不拖尾，而且水与甲醇比例的改变以 及pH 的变化都不影响峰的对称性。 ④ 在流动相中加入一定量的电解质缓冲盐，改变流动相的离 子强度，稳定pH及促进离子对相互作用，而起到改善峰形 及分离效果的作用。

——封尾技术，减少残余羟基，增加单体覆盖度。 (2) 改进固定相 ——封尾技术，减少残余羟基，增加单体覆盖度。 封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。由于C18烷基硅烷相对较大的体积，使得C18 和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的 50% 。 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。

反相HPLC的流动相： 中性的——不加酸碱。 酸性的——磷酸、磷酸盐缓冲液。 碱性的——三乙胺、氨水。 酸碱系统——既有酸又有碱。 液-固吸附色谱： 固定相——原型硅胶 分离机理——生物碱的碱性，与亲脂性无关； 流动相——常用甲醇-醋酸盐缓冲液； 优点——可排除酸性和中性杂质的干扰；且流动 相组成比较简单。

离子交换色谱法： 固定相——阳离子交换树脂 分离机理——利用质子化的生物碱阳离子与离子 交换剂交换能力之间的差异而分离。 HPLC的检测器： UV、电化学、化学发光、荧光、质谱 例1: 烧伤止痛膏中小檗碱的含量测定(RP－HPLC法) ※ 十二烷基磺酸钠的作用：离子对试剂，减少硅羟基 的影响。 例2：小儿清热止咳口服液中盐酸麻黄碱的含量测定 (RP－HPLC法)

适用范围：有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。如：麻黄碱、槟榔碱、苦参碱和颠茄类生物碱等。 3.气相色谱法 适用范围：有挥发性的，遇热不分解的生物碱类。如：麻黄碱、槟榔碱、苦参碱和颠茄类生物碱等。 供试液的制备应采用冷提取，净化过程也要避免加热，一防成分流失，最后用氯仿等低极性溶剂为溶媒制备成供试液。 4.毛细管电泳法

五、常见生物碱成分分析 化合物名称 结构式 理化性质、结构及 光谱特征 常用定量分析 方法 小檗碱 （黄连素） Berberine (Umbellatine) （C20H18NO4；336.37） 异喹啉类原小檗碱型 生物碱、季铵型生物碱、有共轭体系。 黄色结晶、碱性较 强，易溶于热水或 热乙醇，微溶或不 溶于苯、氯仿、丙 酮，其盐酸盐水中 溶解度小。 mp：1450 ℃ UV：225 ，270 ，331。 重量法、滴定法 分光光度法 薄层扫描法 薄层荧光扫描法 高效液相色谱法 脉冲极谱法 流动色谱分析法 酶法

化合物名称 结构式 理化性质、结构及光谱特征 常用定量分析方法 士的宁 （番木鳖碱） Strychnine （C21H20N2 O2;334.40） 单萜吲哚类生物 碱、环叔胺显碱 性、酰胺不显碱 性。 难溶于水，可溶于乙醇，甲醇。易溶于氯仿，微溶于乙醚。 mp：268～290℃。 UV：282。 重量法 滴定法 分光光度法 一阶导数分光光度法 薄层扫描法 高效液相色谱法

化合物 名称 结构式 理化性质、结构及光谱特征 常用定量分析方法 乌头碱 Aconitine （C34H47 N O11; 645.76 ） 二萜类酯型生物 碱。 易溶于氯仿、苯、 无水乙醇和醚， 难溶于水、微溶石油醚 mp：204℃ UV:281,273,230, 202． 滴定法 酸性染料比色法 一阶导数紫外分光光度法 薄层扫描法 高效液相色谱法