植物呼吸作用-組織拓印法分析 植物生理學實驗 13 Determination of respirarion 授課教授:傅士峯老師

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植物呼吸作用-組織拓印法分析 植物生理學實驗 13 Determination of respirarion 授課教授:傅士峯老師 助教:呂學宇、張凱雅 值日組:G12 104/12/30

實驗目的 測定植物組織的總蛋白質分布和呼吸作用酵素之間的相對位置,並了解蛋白質測定之基本方法和原理

實驗原理

TTC(Triphenyl tetrazolium chloride) 氧化態為無色,可被氫還原成不溶性的紅色三苯甲腙 (Tripheny formazan, TPF ) 具活力的組織在進行呼吸作用,能進行氧化還原反應,可將無色的 TTC,還原成紅色的三苯甲腙 不具活力的組織則無此反應 藉呼吸酶活躍情況,反應組織活力強弱 TTC (無色) TPF (紅色) 種子一吸水就有酵素反應、蛇在冬眠也會呼吸 用TTC作為NADPH或NADH的氫受體 TPF在空氣中不會自動氧化(非常穩定) 氧化態 還原態

Ponceau S(麗春紅染劑) 水溶性、陰離子染料 用於檢測膜上是否有蛋白質轉移 Ponceau S 可與蛋白質的氨基結合,顯示紅色 染液可回收並反覆使用10次以上 靈敏度:250 ng 带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合,也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合

Nitrocellulose membrane 硝化纖維膜 緩衝液的環境下,大多數的蛋白質會吸附在紙上的硝基,並且高親和力的結合 氫鍵抓極性 compound 蛋白質有ph值問題 蛋白質有氧和代負電的 容易和但正電的小分子吸引 酸性-帶正電 NH基團-很強搶電子的基團.電子被拉往N,H帶正電-提供氫鍵-用H抓帶負電的原子 http://www.bestestsh.com/bestest-Products-11035555/

實驗步驟 x2 NC membrane 浸泡 1x PBS 用刀片切割植物枝條(橫切)和玉米(縱切) 重複 2~3 步驟一次 等待 NC membrane 乾燥 兩張 NC membrane 分別染: Ponceau S(染蛋白質), TTC(測呼吸作用) 拓印順序:芹菜、蘆筍、玉米、自備枝條 x2

實驗結果 比對拓印染色結果: 哪個染色結果的範圍應該較廣? 結果是否符合預期? Ponceau S (測總蛋白質) TTC test (測呼吸酵素)

問題討論 在蛋白質轉印實驗中,除了使用消化纖維膜之外,還有什麼材料能使用?

報告繳交 報告格式:實驗目的、原理、結果、問題討論、補充資料、心得 實驗13 繳交期限:1/6(三) 17:00 精緻報告(G6-G13)期限:1/6(三) 23:59 報告格式可參考G3範例 (已上傳教學平台) 包含:卡通圖原理、卡通圖關鍵步驟、照片流程、照片結果

The End