神经干细胞的研究现状 与应用前景 龙 跃 生 2008年9月26日

主 要 内 容 基本知识 成年神经干细胞的研究现状 研究方法 应用前景 神经干细胞的定义、特点、标志、分布及分化因素等基本知识 神经干细胞的来源、分离、培养及鉴定方法 应用前景 神经干细胞技术在神经系统疾病治疗中的应用 神经干细胞与神经心理学

基本知识

干细胞的概念 干细胞（Stem cell，SC）是一类具有自我更新（self-renewing）能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，也有人通俗而形象地称其为“干什么都行的细胞”。 干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织如骨髓、脐带等。干细胞技术最显著的作用就是：能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。 干细胞技术是近年现代生物科技继克隆技术、基因工程之后的第三大科学成就。 它不仅促使人们重新熟悉细胞生长与分化的基本生命原理，也为多种难治性疾病的治疗带来了划时代的革命。21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景。

神经干细胞的定义 1989年，Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞。其后从成年鼠纹状体、海马齿状回等处分离出能在体外不断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群。 20世纪90年代后，许多实验都证实，人脑内也同样存在神经干细胞。 目前得到普遍认可的神经干细胞的概念是由Mckay在1997年提出的：神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。 1

(Okano et al. 2002)

神经干细胞的分化、增殖及其影响因素 1． 生长因子： FGF－2（碱性成纤维细胞生长因子－2）在胚胎早期维持神经祖细胞的的生存，促进其增殖。 　　ECG（神经表皮生长因子）在发育较晚期促使神经祖细胞增殖和分化。 　　BDNF（脑源性神经营养因子）及IGF1（胰岛素样生长因子1）主要促进祖细胞向神经元方向分化。 2． 细胞因子：红细胞生成素、集落刺激因子、白介素家族等影响神经元的发育；BMP（骨架多型性蛋白）促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。 3． 移植区域的信号：一是选择性调控，即信号只能调节干细胞的存活和增殖而不能影响其分化方向。二是指导性作用，指特异性指导神经干细胞、祖细胞向特定谱系分化。 4．神经干细胞和神经祖细胞自身产生多种调控信号。 5． Nestin基因和Notch基因：人nestin基因第二个内含子中存在一个（〈400bp区域〉对神经干细胞起增强作用。这个增强子也对早期神经干细胞其他基因表达起作用，包括Notch基因。Notch基因是在中枢神经系统发育过程中确定神经元数量的重要调控基因。

神经干细胞的形态

神经干细胞的特征 ①有增殖能力。 ②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。 ③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。 自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。

神经干细胞的分类 1.根据分化潜能及产生子细胞种类不同分为： 胚胎期 神经管上皮细胞 放射状胶质神经元 神经母细胞 成年期 幼年期 大脑中皮质及神经核等 的基本神经组织细胞 神经前体细胞 神经元 各类神经胶质细胞 各类神经细胞的前体细胞

2.根据部位分类主要有两类： 神经嵴干细胞(neuralcreststemcell，NC-SC)和中枢神经干细胞(CNS-SC)。 NCSC为外周神经干细胞(PNS-SC)，既可发育为外周神经细胞、神经内分泌细胞和Schwann氏细胞，也能分化为色素细胞(pigmented cell)和平滑肌细胞等。NSC一般是指存在于脑部的中枢神经干细胞(CNS-SC)，其子代细胞能分化成为神经系统的大部分细胞。

神经干细胞的分布 胚胎期： 神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域。 成年期： 　神经干细胞主要分布在大脑的皮层、纹状体、海马、室管膜下层和中脑等区域。 成年期： 　中枢神经系统仍有神经干细胞存在，只不过这些细胞平时处于静止状态。成年脑区神经干细胞主要局限在海马齿状回、纹状体和环绕侧脑室的室脑膜下层。

海马齿状回

侧脑室的室脑膜下层

尾状核 皮质 背侧丘脑 髓质 基底核 侧脑室 豆状核 尾状核与豆状核合称纹状体

成年神经干细胞的研究现状

成年神经干细胞的功能 以前的观点认为成年大脑中的神经元数量是稳定不变的，由这些神经元构成的神经网络结构是相对稳定的，神经结构上的可塑性仅发生在树突、轴突和突触等部位。而目前对神经再生和成年神经干细胞的研究增加了新的认识。

小结 成年海马的神经再生与海马功能有着密切关系。学习或奔跑可以改变动物海马细胞存活或细胞增殖水平，从而增加海马的新生神经元的数目。紧张、滥用鸦片和癫痫发作等都可以影响到成年海马齿状回新生神经元的增殖和分化水平。人为减少海马颗粒样神经元的数目，经过处理后的动物其海马依赖的记忆功能受到损害。 成年海马神经干细胞产生的新生神经元不仅在形态上与成熟海马神经元相同，而且对突触刺激有动作电位反应，并且可以有效地整合到神经环路中去。 人们推测，这些由神经干细胞产生的新生神经元是参与其所在海马区域的正常功能。神经干细胞和学习记忆关系的研究是复杂的。尽管海马具有记忆的存储功能，但这种记忆的存储是短暂的，只是为皮层区域的长时程记忆做时空上的准备。

成年神经干细胞对脑损伤的修复作用 control kindled Examples of BrdU positive nuclei in hippocampal sections from control

成年神经干细胞导常可能导致疾病发生 正常情况下，成年啮齿类动物大脑中有大量的新生神经元不断产生，显然这些细胞是来补充已经缺失的神经元，这样成年大脑神经元数目才能保持相对稳定。研究表明在成年大脑神经再生区域里存在着普遍的神经元凋亡现象。神经再生活跃区域的死亡细胞数倍于大脑其他部位，因而干细胞增殖、祖细胞迁徙并且分化成神经元从而替代死亡的神经元。有人推测，中枢神经系统变性疾病形成的原因就是由于内源性神经干细胞不能对这些疾病产生的信号起反应，内源性神经干细胞不能替代变性的神经元，而最终导致老年性疾呆，癫痫，精神分裂症等神经系统退行性疾病的发生。

成年神经干细胞研究面临的问题 1. 成年神经再生和早期发育中的神经生成有哪些不同？ 2. 为什么神经再生只存在于成年大脑的某些特定的区域？ 3. 这些区域的局部微环境对成年神经干细胞的迁徙和分化有些什么影响？ 4. 成年大脑的神经可塑性的功能意义？ 5. 神经干细胞和认知等高级功能神经活动的关系？

研究方法

神经干细胞的来源 来源于神经组织：目前从哺乳动物胚胎期大部分脑区、成年期的脑室下区、海马回的颗粒下层、脊髓等部位均成功分离出神经干细胞 来源于胚胎：胚胎干细胞( embryonic stem cells ,　ESCs) 、胚胎生殖细胞( embryonic germ cells ,　EGCs) 等细胞的定向诱导分化而来。 来源于血液系统：骨髓间质干细胞( bonemarrow mesenchymal stem cell s ,　MSCs) 、成年多能祖细胞( multipotent adult progenitor cells ,MAPCs) ［10］ 及脐血细胞(umbilical cord blood) ［11］ 。 来源于永生化细胞系：C17. 2 细胞系［12］ 、MHP36 细胞系［13］ 、N T2 细胞系。 体核细胞转移技术获得神经干细胞：将体细胞核植入去核的卵母细胞浆中,再程序化后形成治疗性克隆,让其发育到一定阶段后在相应部位获得神经干细胞,可重建组织相容性。

神经干细胞的分离与纯化 （1）反复传代法：取3～4个月龄的人胚胎纹状体或孕 14～16天小鼠、大鼠胚胎大脑，机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养，实现NSC的体外稳定有效扩增。经过长期培养反复传代可使NSC得到纯化。 （2）流式细胞术：Sasaki等采用流式细胞仪对约60种细胞表面抗原进行筛选，结果发现分选出的具有CD133+/CE34+/CD45-（细胞表面抗原）的细胞为NSC。 （3）基因转导：Keyoung 等利用腺病毒为载体,将置于归巢素和Msi1增强子和启动子控制下的绿色荧光蛋白基因导入人胚胎细胞,然后对胚胎细胞进行体外培养,只有NSC能特异性地出现绿色荧光蛋白。再利用流式细胞仪进行荧光筛选,能进一步将NSC收集起来。 （4）免疫磁珠细胞分选法：利用磁珠表面的特异性抗体与NSC表面抗原结合，在磁场作用下使结合磁珠的NSC与其他细胞分离，从而得到较纯化的NSC。

神经干细胞的鉴定 　　1990年，Lendahl的实验证实，神经干细胞的标志蛋白是神经上皮干细胞蛋白（nestin）．Nestin在神经胚形成时开始表达，随着神经细胞的迁移和分化的完成，Nestin的表达量逐渐下降甚至完全停止。目前，Nestin已被用于神经干细胞的鉴定。 培养的小鼠神经干细胞　　　　　　胚胎小鼠脑侧室　　　　　　　　胚胎小鼠纹状体

Sakakibara等人鉴定出一种RNA结合蛋白即 Musashi ,可作为NSC的标志物。 E10 E14 Ventricular zone of spinal cord (Sakakibara et al. 1996)

　　对分离培养得到的NSC进行标记时发现：Nestin和Musashi呈双重阳性,且随着NSC分化成为神经元,二者的标记作用也消失,说明Musashi具有与Nestin相似的特异性和种间保守性。Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSC的鉴定。 m-Msi-1 nestin (Sakakibara et al. 1996)

应用前景

NSC原位诱导内源性NSC的自身激活 　理论依据：大量体外和在体实验已经证实成年脑中存在NSC。研究影响NSC增殖和分化的信号作用的实验证实：脑室管膜下区等部位的NSC在脑损伤发生后能够增殖，并迁移到受损部位并分化成新的神经细胞，取代受损脑组织细胞。 　存在困难：在大多数情况下,仅由内源性干细胞产生的神经组织可能不足以替代损伤后缺失的神经组织,尤其在脊髓、纹状体等神经组织发生很少的部位。 　可能原因： (1)原位诱导出功能特异的神经元可能需要多种刺激和特定细胞因子的作用。(2)患者中枢神经系统的干细胞缺陷或无法激活。

异体神经干细胞移植 依据：临床试验表明，移植胎儿脑组织治疗神经系统退行性疾病可以明显改善症状；在体外培养扩增的NSC移植到脑疾病动物模型脑内的实验表明，体外培养的NSC移植到脑内后能够迁移分化为特定部位的神经细胞，其分化方向与所处的微环境密切相关。 问题： （１）但胎脑的来源有限，受伦理和法律上的束缚，限制研究的发展；（２）在研究细胞移植治疗帕金森病时发现,在体外实验中没有必需的因素干预下, NSC自然分化为多巴胺能神经元的比例只占细胞总数的0.5%～5%。 　　因此，诱导NSC向修复所需的神经功能(目的)细胞分化成为研究的核心问题。

基因治疗 基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内,使其获得表达,达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。 　　　基因治疗是通过特定载体相关外源基因导入体内,使其获得表达,达到治疗由于某种基因缺陷或突变引起的疾病。 　　　目前神经系统基因治疗常用的靶细胞有：(1)成纤维细胞,来自间充质,能在体外分裂增殖,具有较高的病毒感染率但植入脑后不能与宿主整合；(2)永生化神经祖细胞,体外容易进行基因转导和能与宿主整合等优点,但存在致癌的危险；(3)NSC来源于神经组织,比永生化NSC更能保持原有的生物学特性,具有分化能力和更好的组织相容性,可以整合到宿主脑组织并向周围迁移,不形成肿瘤等。

神经系统疾病的药物筛选平台 　　　NSC具有稳定的生物学性状,建系以后可以获得均一的遗传背景,具有组织和种属特异性，可作为神经系统疾病的药物筛选平台。利用NSC的多向分化潜能,可筛选出控制和促进NSC向终末细胞分化的药物。

神经干细胞用于治疗的可能机理 １、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。 ２、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。 ３、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路

神经干细胞治疗疾病的意义 　　　传统的药物治疗效果不令人满意，吃药只可暂时性的控制疾病，一旦停药，病症复现甚至更严重。常年服药不仅让患者痛苦不已，而且对身体造成极大的危害，导致 其他严重疾病的并发。药物不具备激活脑神经细胞的功能是根本原因，所以要想从根本上治疗脑病等神经系统疾病，借助外界移植神经干细胞是唯一有效的方法。 　　　科学研究证明了神经干细胞的定向分化性，使修复和替代死亡的神经细胞成为现实。为了减少神经损伤的后遗症，延缓或抑止疾病的进一步发展，取得更好的恢复效果，从根本上修复和激活死亡神经细胞是十分必要的。

存在问题 神经干细胞移植后神经是否存在有免疫反应? 神经干细胞移植是否有产生肿瘤的可能? 神经干细胞脑内移植的最佳时机是什么? 虽然神经干细胞在取得一定进展,但大多是在动物实验上,应用于临床还需一段时间。 目前,神经干细胞的增殖、分化及定向、远距离迁移的调控机制还不清楚。 移植用细胞类型是选择神经干细胞还是定向诱导后的成熟细胞或介于两者之间的祖细胞,还没有系统的比较研究。 神经干细胞的建系及神经干细胞作为转基因载体治疗神经系统疾病的疗效和安全性等问题均有待解决。

神经干细胞与神经心理学

神经心理学概述 神经心理学不象神经生理学那样单纯地解释脑本身的生理活动，也不象心理学那样单纯地分析行为或心理活动本身。它是从神经科学的角度来研究心理学的问题。人们需要了解人脑是如何反映外界环境中的事物，如何反映社会现象，如何产生心理活动以及心理活动与大脑的生理活动究竟是什么样的关系。神经心理学则正是把脑当作心理活动的物质本体来研究脑和心理或脑和行为的关系。它把人的感知、记忆、言语、思维、智力、行为和脑的机能结构之间建立了量的关系，用标志脑机能结构的解剖、生理、生化的术语来解释心理现象或行为。它综合神经解剖学、神经生理学、神经药理学、神经化学和实验心理学及临床心理学的研究成果，采用独特的研究方法，成为心理学与神经科学交叉的一门学科。

各种心理活动的神经生物学基础

形成大脑皮层各个功能区域 神经干细胞 胚胎期 神经管上皮细胞 放射状胶质神经元 神经母细胞 幼年期 成年期 大脑中皮质及神经核等 的基本神经组织细胞 各类神经胶质细胞 神经元 形成大脑皮层各个功能区域

遗传 环境 多种调控因素 形成大脑皮层 各个功能区域 神经干细胞

环境因素 按性质，环境因素分为两大类： 一、是指生物有机体所共有的维持生存所必需的自然环境，如食物营养、地理气候等； 二、是指人类的社会环境，即个体所处的社会生活条件和教育条件，包括家庭、社会、学校等方面的各种影响。环境和教育规定了心理发展的现实性

环境因素 按人体发育过程，环境因素分为： 一、胎内环境 二、幼儿成长环境

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