滅菌完成後之培養基可依實驗需求進行下列步驟： 冷藏備用。 在無菌的環境中，以玻璃無菌吸管吸取15~20 ml培養基置於無菌培養皿中，冷卻至凝固備用，即為平面培養基。 在無菌的環境中，以玻璃無菌吸管吸取適量培養基置於無菌的玻璃試管中（體積約在試管容量的1/2以下）。在培養基未凝固之前，可將試管直立向下並予以傾斜，冷卻至凝固備用，即為斜面培養基（圖6-1）。
細菌的接種 目的 原理 材料與儀器 步驟與方法 實驗注意事項 實驗結果
目的 此實驗之主要目的為分離出單一菌落以達到純菌培養之需求。目前常用於分離菌種的方法有四種，分別為菌落懸浮法、劃線法、塗抹法與穿刺法。本實驗主要為教導學生學習如何進行細菌接種之方法（菌落懸浮法、劃線法、塗抹法與穿刺法），並同時了解無菌操作之概念及步驟，以便日後可順利進行微生物之培養。
原理 無菌操作技術為微生物實驗的基礎，經由無菌操作技術可確保培養之微生物保持在純菌狀態。在實驗室中最常使用的無菌操作實驗為次代培養，即為將一純菌由一個培養基移至另一個培養基並使其能繼續生長；另一個則為分離純菌之方法，即利用無菌操作之原理以達到分離出單一菌落之目的。
材料與儀器 菌種 材料 設備儀器及其他用具
菌種 Escherichia coli菌株及Escherichia coli隔液培養液
材料 75%酒精
設備儀器及其他用具 平板空白培養基 空白斜面培養基 空白液體培養基 恆溫培養箱 酒精燈 打火機 接種環 L型玻棒 微量吸管 接種針
步驟與方法 菌落懸浮法 劃線法 塗抹法 穿刺法
菌落懸浮法 菌落懸浮培養法多用於微生物的增殖，其操作流程如下： 保存之Escherichia coli菌株取出備用。 將菌株以經火滅菌並冷卻過之接種環取出。 再將含菌株之接種環置入內含有nutrient broth之液體培養基。 完成接種後標示，並置於37℃之恆溫培養箱進行24~48小時培養。 待培養完成後，可用肉眼觀察培養基之濁度、顯微鏡計算細菌數目或以比色計測定吸光度來判斷細菌生長之情形。
劃線法 保存之Escherichia coli菌株取出備用（或可準備Escherichia coli之培養液）。 斜面培養基接種法：以過火滅菌之接種環挑取菌株（或菌液）於斜面培養基上劃線。劃線的方式為自管底往管口方向，沿著培養基表面以Z形劃線（圖6-2）。 平板培養基接種法：以左手拿培養皿，右手拿接種環之方式，挑取上述菌株或菌液並於平板培養基上劃線。劃線的方法共有三種（如圖6-3），不管使用何種劃線方法，其目的皆是透過劃線的動作將細菌液在平板上進行稀釋，使細菌得以形成單一菌落。
用接種環以無菌操作方式，先在平板培養基的一邊作第一次平行劃線（約3~4條），接著再將接種環上殘留之菌體利用火焰滅菌，然後再轉動培養皿約90度角，待接種環冷卻後通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線然後再重覆滅菌步驟通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線（如圖6-3(a)），如此利用接種環在培養皿上之固體營養基表面逐次劃直線，每次起始點均涵蓋上次直線之末段，使其達到逐漸稀釋之效果。 劃線完畢後，蓋上培養皿蓋，以倒置方法置於37℃恆溫培養箱培養24~48小時，待培養完畢後觀察菌落生長情形。
塗抹法 準備Escherichia coli液體培養菌液備用。 將菌液以無菌微量吸管吸取約03~05 ml並加入事先已準備好之平板培養皿中。 將浸泡於75%酒精中之L型玻棒取出後以火焰滅菌冷卻後，使用L型玻棒在含有菌液的平板培養皿中來回以同心圓的方向展開，直至菌液被培養基吸收為止。 蓋上培養皿蓋後，等培養基表面乾燥，以倒置的方式置於37℃恆溫培養箱中培養24~48小時。 待培養完成後以肉眼觀察菌落之形成及計算菌落生成菌數。
穿刺法 使用穿刺法進行細菌接種時必須用筆直的接種針，而不能使用接種環。此方法多用於厭氣及兼性厭氣菌的菌種保存用途。其實驗操作流程如下： 將保存之Escherichia coli以火焰滅菌並冷卻過之接種針取出。 取一空白斜面培養基試管，首先打開試管口以火焰滅菌，接著將帶有Escherichia coli之接種針筆直插入新的斜面培養基試管中，一直插到接近試管管底，再抽出接種針，即完成穿刺接種。進行穿刺接種時應注意勿使接種針在培養基內左右移動，以使穿刺線整齊，方便觀察細菌之生長結果。
將試管管口再以火焰滅菌，封蓋，標示後置於37℃培養24~48小時，待培養完成後即可以肉眼觀察細菌之生長情形。
實驗注意事項 接種時，接種環或接種針於使用前需過火滅菌，適當冷卻後，方可取菌，以避免菌種死亡。 菌落懸浮法，將菌落接種至NB之液體培養基中時，可將液體培養基的管口過火加熱，以免雜菌干擾。 做劃線或塗抹法接種時，蓋子避免全開或於火源附近操作以免空氣落菌影響結果。
觀察菌落懸浮法結果時，需適當的搖晃試管才可觀察，以免菌種沈澱於試管底部而影響觀察。 以接種環進行劃線法時，注意勿劃傷培養基的表面。
實驗結果
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