精品课程 项目五 组培苗的培养 咸宁职业技术学院

组培苗的培养 组 培 苗 的 养 生 根 培 养 初 代 培 养 继 代 培 养 组培苗生产中常见问题及控制

一、培养含义 将植物材料经培养，使之生长，分裂分化形成愈伤组织、芽、胚状体、原球茎，进一步分化成再生植株或产生代谢产物的过程。

二、培养步骤 植物组织培养 初代培养 继代培养 生根培养

1、初 代 培 养 目 的：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体、原球茎。 目　的：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体、原球茎。 培养基：诱导或分化培养基。 培养基中CTK多，IAA少。 类　型（根据发育方向）： 　　短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型、原球茎的发生型

初代培养

短枝发生型 微型扦插 顶 芽 侧 芽 CTK刺激 形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状 带芽的茎切段 接种培养 茎段培养继代扩繁 生根培养 顶　芽 初　代 侧　芽 CTK刺激 形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状 带芽的茎切段 接种培养 无愈伤组织产生 茎段培养继代扩繁 继　代 生根培养 获得较多嫩茎梢 试管苗

丛生芽发生型 顶芽 腋芽

不定芽发生型Ⅰ

不定芽发生型Ⅱ 脱分化 外植体 愈伤组织 ① 分　化 初　代 ② 芽、芽丛 切割芽丛 继代培养 继　代 生根培养 试管苗 大量芽丛

愈伤组织培养 已分化细胞 脱分化 诱导期 具分裂能力的细胞 分 裂 分裂期 愈伤组织 继 代 分化期 愈伤组织

菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察 胚状体发生型 菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察

原球茎发生型 原球茎——指缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。 大花蕙兰原球茎增殖与植株再生

2、继 代 培 养 目的：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽），扩繁无根苗（生产上边扩繁边生根）。 扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段,分离芽丛、胚状体、原球茎。 培养基：基本培养基或分化培养基 实质：增殖培养物

3、生根培养 3、生 根 培 养 ◆目的：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。 ◆生根培养基：1／2或1／4MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。 ◆培养条件：增加光强，达3000-10000lx。

3、生根培养

生根方法与途径 ①新梢基部浸入50或100ppmIBA液4－8h； ②在含IAA类培养基中培养4－6d； ③移入含IAA类的生根培养基培养。 ④生根困难的则在培养基中搭滤纸桥或按①

生根方法与途径 ⑤延长在增殖培养时间 ⑥降低增殖倍率，减少CTK用量 ⑦对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根 ⑧胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根

外植体成苗途径 　　外　植　体 根、芽 　　试　管　苗 愈伤组织 芽 根 根 芽 胚状体 原球茎 根、芽 根、芽

三、组培苗生产中常见问题及控制 1 污染问题 常见问题 2 褐变现象 3 玻璃化现象

（一）污染问题 1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。

2、污染特点 ⑴细菌污染特点：菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径：外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程 ⑵真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径：周围环境不清洁、超净工作台过滤装置失效、培养瓶的口径过大

3、污染的预防措施 （1）防止材料带菌的措施 茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。 晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。 接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。

3、污染的预防措施 （2）外植体的灭菌 （3）器皿与金属器械的灭菌 多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠 多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。 （3）器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般灼烧灭菌，也可干热灭菌

3、污染的预防措施 （4）布质制品的灭菌： 湿热灭菌 （5）无菌操作室的灭菌 （6）严格按照操作程序。 2%新洁尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 （6）严格按照操作程序。

（二）褐变现象 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。

1、褐变的原因 ⑴植物种类和品种 某些植物酚类物质含量较多。 ⑵外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。 ⑴植物种类和品种 某些植物酚类物质含量较多。 ⑵外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。 ⑶材料转移时间 时间过长引起材料褐变。

1、褐变的原因 ⑷培养基的成分 过高的无机盐浓度 生长调节物质使用不当，BA过多 分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制 培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。

2、褐变的防止措施 ⑴选择适宜的外植体及最佳培养基。 ⑵连续转移，诱导培养初期 。 ⑶加抗氧化物。 ⑷加活性炭，0.1-0.5%活性炭。

（三）玻璃化现象 玻璃化是植物材料进行离体繁殖时，有些组培苗的嫩茎、叶片出现半透明状和水渍状的现象。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化是试管苗的生理失调症。

1、玻璃化现象产生原因 ⑴激素浓度 高浓度的细胞分裂素会使玻璃化的发生比例提高。 ⑵琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加。 ⑶温度 温度高易形成玻璃化苗。

1、玻璃化现象产生原因 ⑷光照 光照偏弱易形成玻璃化苗。 ⑸通风条件 培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。 ⑷光照 光照偏弱易形成玻璃化苗。 ⑸通风条件 培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。 ⑹离子水平 植物种类不同，离子形态比例量要求不同。

2、玻璃化现象预防措施 ⑴控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。 ⑵提高蔗糖和琼脂浓度 ⑶降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。 ⑷增加自然光照1000-1800lx，控制光照时间。 ⑸控制温度，适当低温处理，避免过高的培养温度。 ⑹使用透气性好的封口膜。 ⑺培养基中加入间苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壮素。