实验目的: 1、了解PCR反应原理; 2、掌握PCR扩增的基本操作步骤

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实验目的: 1、了解PCR反应原理; 2、掌握PCR扩增的基本操作步骤

聚合酶链式反应(PCR)五要素 引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA 引物 决定待扩增基因片段的特异性 酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 模板 双链DNA 缓冲液(内含Mg2+)

引物浓度不宜偏高,否则: 容易形成引物二聚体 容易产生非特异性产物。 一般终浓度用0.1~0.5 pmol/μl(μM )较好。 贮存液:100 μM 工作液:10 μM

本实验用Taq DNA聚合酶 1、延伸速度: 2~4kb/min 2、延伸长度: <6kb 3、最佳反应温度: 70~75℃ 3、最佳反应温度: 70~75℃ 4、最佳Mg2+ 浓度:1~2mM Mg2+过高,非特异性增强; 过低, Taq DNA聚合酶活性减少 5、3’加A,便于 TA克隆 酶的浓度也要适中,过低过高都不好

dNTP:dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP的混合物 1.等摩尔浓度配制,否则就会引起错配 2.每种dNTP 50~200μmol/L 3.浓度过高会抑制PCR反应:与Mg2+ 螯合

PCR缓冲液(10×): 200mM Tris-HCl( PH8.8) 100mM KCl 15mM MgCl2 100mM 硫酸铵 1% Triton X-100

PCR反应程序 95℃预变性5 min, 94℃变性 30s-1min X℃退火 30 s-1min 30-35循环 72℃延伸Y min 4 ℃ 保存 X:Tm-(2~10) Y: 1kb扩增产物约1min

反应体系 2.5 μl 10× PCR缓冲液 Buffer 0.5 μl 10 mM dNTP dNTP 0.5 μl 10 μM 上游引物 P1 0.5 μl 10 μM 下游引物 P2 1.0 μl 10~100 ng/μl 模板DNA T 0.25μl 2U/ μl Taq DNA聚合酶 E 19.75μl dd H2O 25μl 反应体系