programmed cell death, PCD 细胞凋亡 Apoptosis programmed cell death, PCD 徐霞 细胞凋亡（apoptosis）是由基因调控的主动而有序的细胞死亡，又称程序性细胞死亡（programmed cell death ,PCD）。 1. 维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。 2. 在胚胎发育中起重要作用：  手指和脚趾的形成等。  大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。  蝌蚪的尾巴可在甲状腺素的作用下消失。 在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。 心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。 3. 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。

凋亡细胞的形态学和生化特征： 细胞皱缩 质膜出泡 染色质浓缩 DNA裂解：DNA ladder 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧 凋亡小体的释放

核酸内切酶活化与DNA片段化是凋亡的生物化学标志。 DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当核酸内切酶在核小体连接部切开DNA时，即可形成180～ 200bp或其整倍数的DNA片段。这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征的阶梯状（ladder）条带，是判断细胞凋亡的客观指标之一。

DNA ladder DNA 180bp endonucleolytic DNA fragmentation nucleosome core histone DNA 180bp chromatin

细胞凋亡过程（四个阶段）： 1. 凋亡信号转导 2. 凋亡基因激活 3. 凋亡的执行（由DNase 和caspases执行） 4. 凋亡细胞的清除。

细胞凋亡信号的转导 凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序 细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。 凋亡诱导因素 作用于 细胞 转化为 凋亡信号 胞内信号转导途径 激活细胞死亡程序 细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体等）。 细胞凋亡主要有三条通路： 外源性通路（死亡受体途径） Fas, TNF… 内源性通路（线粒体途径） 内质网通路

细胞凋亡的三条通路 紫外线等 （如FasL）→（如Fas）→FADD→Caspase-8→凋亡酶体 ↓ ↓ 死亡配体 死亡受体 紫外线等 （如FasL）→（如Fas）→FADD→Caspase-8→凋亡酶体 ↓ ↓ DNA损伤 线粒体→Cytc→Apaf-1→Caspase-9→Caspase-3、6、7- P53↑ ↓ ↓ 底物 Bax↑、Bcl-2↓ ↓ 神经酰胺 细胞凋亡 内质网中Ca离子过多 未折叠的蛋白质积累→ →Bax/Bak→ → caspase-12

半胱天冬酶（胱冬酶，Caspase，Cysteine-containing aspartate-spicific protease） N· · · · A-B-C-D-Asp-X · · · ·C 不同的Caspase对ABCD种类要求不同。

Caspase的分类 （1）上游/启动型caspase: 2、8、9、10、12等 （2）下游/执行型caspase: 3、 6 、7等

Caspase的底物 细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白→染色质聚集浓缩。 100多种 细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白→染色质聚集浓缩。 与DNA损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止DNA损伤的修复。如：DNA依赖性蛋白激酶、DNA复制相关蛋白、聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）。 激活DNA酶，促进DNA断裂等。

Caspase的作用 在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器”。 Caspase是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信号传递途经最终激活caspase，caspase通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。但并非所有的凋亡过程都有caspase的参与。

细胞凋亡实验 Hela细胞培养至70-80% 接合，加30μL 大蒜素，培养2hr. ↓ 去除培养液，加PBS 500μL，细胞刮刀刮出细胞吸至EP管， 再用PBS 500μL洗平皿，2000rpm离心2min，弃上清. PBS洗1遍，离心收集细胞（2管） DNA Ladder Caspase-3活性检测 1管 1管

DNA Ladder 细胞沉淀中加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散细胞，使细胞重悬于PBS中。 ↓ 加入4微升RNase A，Vortex混匀。室温放置2分钟 加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀 加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟 （加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合） 加入200微升无水乙醇，Vortex混匀 （加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内） 把上述混合物加入到DNA纯化柱内，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 加入500微升洗涤液I，8000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 加入600微升洗涤液II，12000rpm离心1分钟。倒弃收集管内液体。 12000rpm离心1分钟，以去除残留乙醇 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50μL洗脱液。室温放置3分钟。 12000rpm离心1分钟，所得液体即为纯化得到的总DNA。 （洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收）

琼脂糖凝胶电泳 将抽提得到的DNA 50μL+10Loading buffer 6μL，混匀，上样进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。电压60V，时间3-4hr，观察DNA ladder的形成。

细胞沉淀加入50微升裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟 Caspase-3活性检测 细胞沉淀加入50微升裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟 ↓ 12,000g离心15分钟 把上清转移到预冷的离心管中 立即测定caspase 3的酶活性。同时取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度 设置反应体系： 空白对照管 样品管 检测缓冲液 90μl 50μl 待测样品 0μl 40μl Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μl 总体积 100μl ↓ 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育2hr。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间 计算caspase 3的酶活力单位

空白对照 样品 PBS 20μl 17μl 待测细胞裂解液 0μl 3μl G250染色液 200μl Bradford法测定样品蛋白浓度 室温放置5min 酶标仪测定样品的A570-空白对照的A570 (y) 根据公式计算样品蛋白浓度：y=0.0006x+0.0238

样品中caspase 3催化生成的pNA的吸光度（y）=样品的A405-空白对照的A405 ↓ 通过标准曲线公式：y=0.0025x+0.0103，求出样品中催化产生的pNA的量。 样品单位重量蛋白中所含caspase 3的酶活力单位 = 样品中酶催化产生pNA的量 / 待测样品蛋白浓度

预试结果：DNA Ladder

预试结果：caspase3标准曲线 A 0.033 0.061 0.14 0.274 0.499 C 10 20 50 100 200

蛋白浓度测定标准曲线