2.4 親和層析法 Affinity chromatography 58 2.4 親和層析法 Affinity chromatography 2.4.1 原理概述 Basic principles 要有一對具有高親和性的分子 2.4.2 親和吸著劑 Affinity adsorbent 有很多親和性吸著劑可利用 2.4.3 金屬螯合層析法 Metal chelating 利用分子與金屬的吸引力 2.4.4 疏水性層析法 Hydrophobic interaction 利用分子間的疏水性引力 2.4.5 液相分配 Liquid partition 分子在兩液相間的分配比例不同 說明文字

■ 親和層析法的四項要素 Four essential factors 59 ■ 親和層析法的四項要素 Four essential factors Solid matrix = Sepharose 配 体 Ligand (A) (1) 固相擔體 (2) 專一配對 (3) 耦合反應 (4) 溶離方法 (1) Solid Matrix B 耦合反應 (3) Coupling Reaction 溶 離 Elution (4) A B B (2) Specific Binding Substance (B) B B 圖 3.9  親和層析法的各項要素： 雜 質 contaminants B B 圖 2.12

■ 親和層析法的作用機理 How it works 60 ■ 親和層析法的作用機理 How it works (1) (2) (3) X B Washing Elution A A A Sample B 親和基團 配体 ligand 圖 3.8  親和層析法的作用機理： X B 固相擔体 Solid support 圖 2.11

* ■ 典型的親和層析操作 Typical elution pattern pH 2.05 Elution volume Protein 61 ■ 典型的親和層析操作 Typical elution pattern Elution volume Protein Activity pH 2.05 說明文字 * * 超出管柱容量

+ + - ■ 專一性結合力量的構成因素 Specific interactions I. Conformational Match: 62 ■ 專一性結合力量的構成因素 Specific interactions I. Conformational Match: Van der waals interaction II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der Waals interaction 兩分子間因構形互補所造成的 吸引力是由凡得瓦爾力所貢獻 =O…H-N- Kd + + - 有兩大類力量，構成分子之間的專一性吸引力： 一是兩個分子之間，其構形有如積木般的互補，會因為凡得瓦爾力的關係，產生專一性吸引力 (見下圖)。另一則為兩分子之間，因為某些基團間產生了二級鍵，所造成的吸引力。通常兩個分子間的專一性吸引力的形成，這兩大類力量都會有貢獻。 親和性結合力量的大小，可以用解離常數來表示，一般解離常數至少在 10-6 以上才算有足夠的親和力 (也就是說一百萬對結合分子中，只有一對會解離開來)。 Two types of forces contribute to the specific affinity between proteins

■ 構 形 互 補 所 造 成 的 吸 引 力 Van der Waal interactions 63 ■ 構 形 互 補 所 造 成 的 吸 引 力 Van der Waal interactions 凡得瓦爾鍵數目夠多即足以造就親和力 非極性電子分布均勻 有時電子分布偏向一邊 -d +d vdw vdw 造成短暫耦極 引發鄰近 原子耦極 -d +d -d +d vdw 產生短暫凡得瓦爾力 -d +d 凡得瓦爾力是造成兩個互補平面之間產生專一性吸引力的主因： 凡得瓦爾力 是分子間微弱且短暫的吸引力，多發生在非極性的分子之間；雖然極性分子之間也會有凡得瓦爾吸引力，但其重要性則不若其它二級鍵。 繞在原子最外圍的電子依一定的軌道運轉，而此電子在軌道球面上的分佈通常是均勻的。當兩個原子漸漸接近時，這兩個原子上的電子會相互影響其分佈情形；若其中一個原子的電子分佈非常短暫地發生不均勻現象，則會導致短暫的偶極性產生 (d+．d-)，而這短暫的偶極性馬上誘導另一個原子上的電子，也產生電子分佈不均的現象，但偶極剛好相反 (d-．d+)。 這兩個相反的偶極，便可以產生極微弱且短暫的吸引力，即稱為凡得瓦爾力。 凡得瓦爾力的存在太短暫，因此很容易就散掉；為了達致最大的凡得瓦爾力，兩個原子核之間，要保持在一最適距離；太近則因電子相斥而減弱，太遠則電子間的吸引力又不夠。這個最適距離，即為該原子的凡得瓦爾半徑。 又因為凡得瓦爾力實在很弱，因此要集合數十個凡得瓦爾力才能發揮作用。兩個巨分子間的接面，若其上的對應原子們，每一對都能保持在凡得瓦爾半徑上，則此二巨分子便可產生相當強的親和力量；這只有當兩個巨分子間的接觸面，剛好成為積木般的互補形狀時，才能達成。這種巨分子間的親和力，造就了非常多的細胞生理特性與功能，極為重要。 也有可能轉另一方向 between non-polar surfaces 可能回到原來的狀態

氰 基 -C N 醛 基 -HC=O 酸 基 -COOH 胺 基 -NH2 醇 基 -OH 硫醇基 -SH 醚 -O- 烷 基 -CH3 64 ■ 生化分子的反應基團 Some functional groups 氰 基 -C N ●●●●● 醛 基 -HC=O ●●● 酸 基 -COOH 胺 基 -NH2 ●● 醇 基 -OH 硫醇基 -SH ● 醚 -O- ● 細胞內的反應基團都不是很強： 有機化學裡的強烈反應基團，通常都不會出現在一般的生物分子上。像 KCN 的強反應性物質，對大部分細胞而言根本就是劇毒。最常見的都是一些中等程度的基團，如胺基或酸基等，者兩種基團也是組成胺基酸的重要反應基團，對蛋白質的性質影響極大。 雖然如此，這些中低反應性的基團，還是可以被利用來作為連接用的基團，例如胺基與酸基就可以連成胜汰鍵，是蛋白質的生合成方式。我們也可以利用這些基團，把配体耦合到擔体上去。 烷 基 -CH3 Inert The functional groups in a living cell are mild in reactivity

■ 可與各種配体基團反應的介質 Pharmacia -NH2 -OH -SH 配体基團 親 和 性 介 質 反應基團 反應方式 65 ■ 可與各種配体基團反應的介質 Pharmacia 配体基團 親 和 性 介 質 反應基團 反應方式 -NH2 CNBr-activated Sepharose 4B -C≡N 直接反應 CH-Sepharose 4B 或其活化型 -COOH 加 EDC* N-OH-succinimide Epoxy-activated Sepharose 6B oxirane AH-Sepharose 4B -OH -SH Thiopropyl-Sepharose 6B -S-S-R DTT 活化 Activated Thio-Sepharose 4B -G-S-S-R 表 3.3  可與各種配体基團反應的介質： * EDC = N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl Affinity materials are designed to react with functional groups on ligands 表 2.3

■ 親和性介質的反應基團 Functional groups 66 ■ 親和性介質的反應基團 Functional groups Sepharose CNBr - OH - O - C N NH2 - Protein - O - C - NH - Protein NH - O - C N CNBr activated - NH -C-C-C-C-C-C- NH2 Amino - NH -C-C-C-C-C-C- COOH Carboxylic - NH -C-C-C-C-C-C- C - O-N O N-Succinimide 說明文字 - O-C-C-C-O-C-C-C-C-O-C-C - C O OH Epoxy spacer arm effect

■ 各種親和性介質及其專一性基團 Pharmacia 配 体 (A) 親和性分子 (B) 說 明 抗体 對應之抗原 免疫吸著劑，大多自行合成 67 ■ 各種親和性介質及其專一性基團 Pharmacia 配 体 (A) 親和性分子 (B) 說 明 抗体 對應之抗原 免疫吸著劑，大多自行合成 基質或抑制劑 對應之酵素 酵素的專一性結合 Protein A 部分 IgG 單株抗体純化 Con A 醣蛋白 對 α-D-葡萄糖、甘露糖基有專一性 Heparin 凝血蛋白等 Heparin Sepharose CL-6B Chelator (NTA)-Ni2+ His-tag 表現蛋白質 (His)6 與兩價陽離子間的親和力 Oligo (dT) mRNA Oligo (dT)-cellulose Cibacron-Blue NAD(P)+ 結合酵素 Blue Sepharose CL-6B AMP 或 ADP等 同上 5'AMP-, 2', 5'ADP-Sepharose 4B 單糖及其衍生物 Lectin 用來純化 lectin 表 3.4  各種親和性介質及其專一性基團： Affinity adsorbents with special affinity ligands 表 2.4

Ni Protein His ■ 金屬螯合層析法 Using metal-chelating affinity 68 ■ 金屬螯合層析法 Using metal-chelating affinity Tag Transition metals 過渡元素 His6 Expressed protein Solid support imidazole His Protein Ni d orbiter -O-C-C-C-O-C-C-C-N OH C-COOH 圖 3.10   一種金屬螯合層析法： elution Metal Chelate Affinity Chromatography 圖 2.13

■ 親和層析法實例 Materials used in an example 69 ■ 親和層析法實例 Materials used in an example Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Chitin (solid support) O CH2OH OH NH2 NH O=CH3 Trypsin (target) glutaraldehyde CHOM (ligand, bait) 雞蛋粘多糖蛋白 Chicken ovamucoid Trypsin inhibitor 說明文字

■ 以親和層析法純化 Trypsin purification 70 ■ 以親和層析法純化 Trypsin purification Disc-PAGE SDS-PAGE Chitin CHOM Trypsin A B C&D 先洗去無法吸附的雜質，再溶離下結合在固相擔体上的物質： 先把 胰蛋白脢 的 抑制劑 CHOM 結合到 固相擔体 上，當含有胰蛋白脢的樣本 (A) 通過此擔体時，胰蛋白脢會被 CHOM 抓住，而把雜質洗掉 (B)；雜質洗乾淨之後，再以很低的 pH  (2.05) 破壞其吸引力，而把胰蛋白脢溶離下來 (C & D)。因為胰蛋白脢在低 pH 下很安定，因此其活性都可以保持住，非常適用此種溶離方式。 純化結果可以用電泳來檢定，比較 A 與 B 可以發現，在 B 中有些色帶不見了 (灰色箭頭)，而這些色帶卻在 C 中出現 (深藍色箭頭)，但也多出一個色帶 (淺藍色箭頭)。若把 C 的樣本，同時以 SDS-PAGE 檢定，可以發現只出現一個色帶 (洋紅色箭頭)。請解釋以上這些結果。 以膠体電泳檢定親和層析 操作過程各步驟的樣本 Check by PAGE → A B C = D 相同的樣本卻有不同的色帶？

磷酸鈣陶土 ■ Hydroxyapatite 吸著劑 (Ca5(PO4)3OH)2 可選擇 NaCl 或 磷酸 等不同溶離條件 71 ■ Hydroxyapatite 吸著劑 氫氧基磷灰石 人骨的主要成分 (Ca5(PO4)3OH)2 磷酸鈣陶土 可選擇 NaCl 或 磷酸 等不同溶離條件 Elution by NaCl or phosphate gradient leads to different results 說明文字 具有非常多樣的吸附特性 有負電荷磷酸也有鈣離子 University of Liverpool, ChemTube3D (left) Bio-Rad CHT (right)

■ 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area 蛋白質表面的非極性區域多寡不同 可利用來作為分離純化的手段 (HIC) 72 ■ 蛋白質表面的極性或非極性分布 Hydrophobic area Activie site 說明文字 Superxoide dismutase (SOD) 蛋白質表面的非極性區域多寡不同 可利用來作為分離純化的手段 (HIC) Stryer L (1995) Biochemistry 4/e Fig. 21-36

Reversed phase chromatography (liquid-liquid) 73 ■ 疏水性及反相層析法 Hydrophobic interaction C18 = -C18H37 溶離液由極性轉成非極性 (或相反) HIC (liquid-solid) Reversed phase chromatography (liquid-liquid) Polar solvent Polar solvent Non-polar solvent + Non-polar area Polar phase Non-polar area (liquid) Hydrophobic group (solid) Polar area Using non-polar groups as a stationary phase 圖 3.11  疏水性及反相層析法原理： Using ion-exchanger C6 = -C6H13 Phenyl = -C6H6 有各種不同應用方式 最常被使用在 HPLC 圖 2.14

■ Hydrophobic interaction chromatography (HIC) 74 ■ Hydrophobic interaction chromatography (HIC) BA = beta amylase 100 200 300 400 Ammonium sulfate (% sat.) 5 10 15 20 25 10 20 30 40 50 BA Protein concentration Ethylene glycol (%) 蛋白質表面 非極性區域 很小 非極性區較大 說明文字 由極性到非極性 的梯度 Elution volume (mL) Adapted from Pharmacia - Hydrophobic Interaction Chromatography