第四节 菌种退化、复壮与保藏 在生物进化中： 遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的； 在变异中： 第四节 菌种退化、复壮与保藏 在生物进化中： 遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的； 在变异中： 退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。

一.菌种的退化 1.菌种退化degeneration的表现 生产性状的劣化,遗传标记的丢失, 原有的典型性状的不典型等 菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降，即负突变 致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱

退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。 自发突变率10-8-10-9 加速退化的因素 2. 菌种退化的原因：基因自发突变 退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。 自发突变率10-8-10-9 加速退化的因素 传代次数过多 不适宜的培养条件

3.防止退化的措施 （1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等 保藏培养基： 细 菌：营养琼脂 放线菌：高氏一号 霉 菌：察氏培养基 酵母菌：YEPD高渗培养基。 （3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子 （4）采用有效的菌种保藏方法

二. 菌种的复壮 rejuvenation 狭义复壮 在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施； 广义复壮 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种

1.纯种分离法 平板表面涂布法 平板划线分离法 琼脂培养基浇注法 菌落纯 （菌种纯） 用“分离小室”进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离 菌落纯 （菌种纯） 细胞纯 （菌株纯） 纯种分离法 菌株：又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁殖而成的纯种群体及其后代。因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。

2、通过宿主体复壮：病原菌 3、淘汰已衰退的个体 对S 2、通过宿主体复壮：病原菌 3、淘汰已衰退的个体 对S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢子采用-10～-30℃的低温处理5～7天，使其死亡率达到80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到复壮的效果。

三. 菌种的保藏 （一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理 挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。

低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促反应温度低限-140℃ 措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和剂

（三）菌种保藏方法 1.斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏 措施：低温：4℃ 适用：各大类 保藏期：1-6个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2.石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌蜡液高出培养基1cm→4-15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1-2年 优点：简便

3.砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1-10年 4.冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5-15年或更长

5.甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 → 15-30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中 → 置 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6.液氮保藏法 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶中 措施：超低温（-196℃）、保护剂 适用：各大类 保藏期：>15年

（四）菌种保藏机构 1.中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM 中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)

中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所 中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄

中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部) 农业部兽药监察研究所(NCIVBP) 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院) 中国林业科学院林业研究所(RIF)

2. 美国典型培养物收藏中心 ATCC 3. 美国北部开发利用研究部 NRRL 4. 荷兰霉菌中心保藏所 CBS 5 2.美国典型培养物收藏中心 ATCC 3.美国北部开发利用研究部 NRRL 4.荷兰霉菌中心保藏所 CBS 5.英国国家典型菌种保藏所 NCTC 6、日本大阪发酵研究所 IFO