生物技术大实验 张风丽. 重组 DNA 技术，又称为基因或分子克隆技术 ，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系 列的分子生物学操作步骤。 实验课程的设计从整体上是一个完整的大实 验，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实 验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更 深入的实验做准备（提供实验材料）。

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1 生物技术大实验 张风丽

2 重组 DNA 技术，又称为基因或分子克隆技术 ，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系 列的分子生物学操作步骤。 实验课程的设计从整体上是一个完整的大实 验，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实 验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更 深入的实验做准备（提供实验材料）。 重组 DNA 技术是基因工程的核心技 术

3 基本技术 DNA 的分离纯化 (Isolation and Purification of DNA) ； 电泳技术 (Gel Electrophoresis) ； PCR 技术 (PolymeraseChain Reaction) ； 基因重组、转化、筛选、鉴定（ Gene Recombination, Transformation, Screening, Analysis) ；

4 重组 DNA 技术流程 目的基因 PCR 连接

5 重组 DNA 操作一般步骤 （ 1 ）获得目的基因； （ 2 ）与克隆载体连接，形成新的重组 DNA 分子； （ 3 ）用重组 DNA 分子转化受体细胞，并能 在受体细胞中复制和遗传； （ 4 ）对转化子筛选和鉴定；

6 实验报告 （ 1 ）目的与要求 （ 2 ）实验原理 （ 3 ）实验方法 （ 4 ）结果与讨论

7 主要参考书 （ 1 ）赵斌，何绍江编著《微生物学实验》，科学 出版社， 2002 （ 2 ）刘进元等编著《分子生物学实验指导》，清 华大学出版社， 2002 （ 3 ）周俊宜编著《分子生物学基本技能和策略》， 科学出版社， 2003 （ 4 ） [ 美 ] J 。萨姆布鲁克， D.W. 拉塞尔著, 黄培堂 等译《分子克隆实验指南》，（上，下），第三版， 科学出版社， 2002

8 实验一 细菌总 DNA 的提取

9 （一）实验目的 掌握细菌总 DNA 的抽提方法

10 （二）实验原理 （ 1 ）裂解细胞： SDS （十二烷基磺酸钠）使 蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质裂解细胞， EDTA （乙二胺四乙酸）抑制核酸酶。 （ 2 ）除去蛋白：高浓度的 NaCl 沉淀蛋白质， 酚和氯仿 / 异戊醇抽提分离蛋白。氯仿使蛋白 质表面变性，同时除去残留的苯酚，异戊醇 减少泡沫，有助于分离。 （ 3 ）析出 DNA ：乙醇沉淀使 DNA 从溶液中 析出。

11 （三）实验步骤 1. 接种细菌于 LB 液体培养基， 37 ℃ /28 ℃振荡培养 16- 18h, 获得足够的菌体。 2. 取 1.5mL 培养物倒入微量离心管（ EP 管）,12000rpm 离心 1min ，吸去培养液。 3. 沉淀加入 50µL 溶菌酶 (100µg/mL), 并用取液枪悬浮均 匀， 37 ℃处理 1h 。 4. 向每管加入 200µL 裂解缓冲液，用移液枪吸管头迅速 强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。

12 5. 接着向每管加入 66µL 5M NaCl ，充分混匀后 12000rpm 离心 10min ，除去蛋白质复合物及细胞 壁等残渣。 6. 将上清转入新的 1.5 mLEppendorf 管中，加入 等体积 Tris 饱和酚（取下层溶液），小心上下颠 倒混匀,12000rpm 离心 5min ，进一步沉淀蛋白质。 7. 取上清液，加入等体积的氯仿，小心上下颠倒 混匀,12000rpm 离心 3min ，去除苯酚。

13 8. 取上清液，加入 1 倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀。 12000rpm 离心 10min 。 9. 小心倒去上清液，用 400µL70% 的乙醇洗涤 1 次。 12000rpm 离心 10min, 将获得的 DNA 在室温下干燥。 10. 将获得的 DNA 溶于 30µL 双蒸水中，电泳检测或 -20 ℃ 冰箱放置备用。

14 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳

15 （一）实验目的 掌握鉴定 DNA 的琼脂糖凝胶电泳方法

16 （二）实验原理 DNA 带负电荷，在电场作用下 可以向阳极移动，相对分子量越小， 迁移越快，分子量越大，迁移越慢。 DNA 的构象对迁移速度也有一定的 影响，向阳极迁移的速度超螺旋大 于线状，线状大于开环。

17 （三）实验步骤 1. 称取 0.4g agarose （琼脂糖）置于 250mL 锥形 瓶中，加入 40mLTAE 电泳缓冲液，微波炉中火 加热 1min 至沸，使琼脂糖溶解均匀。 2. 待琼脂糖溶液稍稍冷却 50 ℃左右，加入 2μL Goldview 染色，将溶液倒入制胶盘中冷却。 3. 冷却 30min 后，垂直向上拔出制孔梳子，将胶 放入电泳槽中，加入 TAE 电泳缓冲液直至没过 胶体。

18 4. 在每个点样孔中加入 6μL 样品 (1μL loading buffer ) 。在最左侧的点样孔中加入双酶切 marker 样品。 5.90V 恒压电泳 30-40min 。 6. 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约 1cm 处停止电泳。 7. 观察与拍照 : 在紫外光下观察染色后的凝胶。 DNA 存在处显示出荧光条带。摄像观察保存。

19 注 意 1. 取出梳子之前，一定要等待琼脂糖凝胶凝固。 2. 点样要细心，以免点样枪头刺破凝胶。 3. 电泳时，电极一定要连接正确。 4. Goldview 有一定毒性，操作时必须戴塑料或 乳胶手套 !

20 实验三 目的片段 16S rDNA 的 PCR 扩 增

21 （一）实验目的 掌握 PCR 反应的基本原理和实验技术

22 （二）实验原理 PCR (Polymerase Chain Reaction) 技术就 是在体外通过酶促反应有选择地大量扩增一段 目的基因的技术。 在 94 ℃高温下 DNA 双链变性，分离出单链的 模板，然后降温 55 ℃，让添加的引物与 DNA 单链配对，紧接着温度升高 72 ℃，在 DNA 聚 合酶的作用下， dNTP 开始渗入，并从引物的 结合端开始，按 5’-3’ 方向延伸，合成出新生的 DNA 互补链，这一过程称为一个循环。

23 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链 DNA 解链成为单链 DNA  退火：部分引物与模板的单链 DNA 的特定 互补部位相配对和结合  延伸：以目的基因为模板，合成互补的新 DNA 链

24 目的片段 16SrDNA 的 PCR 扩增 扩增采用细菌 16s rDNA 的通用引物： 27f: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 1492r: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ 扩增片段大小约为 1.5Kb

25 （三） PCR 反应体系 ( 共 40μL ） ( 引物为 27f,1492r) ddH2O 16.6μL Taq 酶 2.5U/μL 0.8μL Primer1 0.8μL Primer2 0.8μL 模板 DNA 1.0μL 2XGolden Fast Reaction Mix 20μL * 按以上反应体系将各种物品加入 PCR 专用 Eppendorf 管 中，混匀。 Primer Final concentration 0.1-1μM 天根 Golden Fast PCR Kit

26 （四）反应程序 将 PCR 管置于 PCR 反应仪中 启动 PCR 循环： 94 ℃， 2min ； 94 ℃， 15s, 55 ℃， 5s, 72 ℃， 25s/1.5kb, 循环 30 次； 72 ℃延伸 2min 。 反应结束后产物置于 4 ℃冰箱中保存。 天根 Golden Fast PCR Kit

27 Agarose 电泳检验反应产物 1. 制胶方法与总 DNA 的检测相同，点样量为 10μL ， 样品组成为： 2μL loading buffer 、 8μL 样品。 2. 在最左侧的点样孔中加入 1Kb marker ：样品组成 为： 2μL loading buffer 、 7μL ddH2O 、 1μL 1Kb marker 。电泳电压为 80V 。

28 菌 DNA M ， DNA Marker ； 1-16 ，菌 DNA 。 箭头所示为菌 DNA. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 结果与讨论

29 1500bp 不同菌株 DNA 作为模板的 16S rDNA PCR 结果

30 1500bp

31 目的 DNA 的纯化及克隆 实验四

32 （一）实验目的 掌握回收 DNA 的方法 （二）实验原理 柱回收法是将树脂做成层析柱，吸附 带负电的 DNA 分子，再用洗脱液将 DNA 从层析柱上洗脱下来，从而达到 回收和纯化 DNA 的目的。 柱回收法操作简单，回收率高。

33 实验前准备 加入 8mL 无水乙醇稀释 DNA Wash buffer, 并于室温保存。 试剂盒编号： D6492-00, D6493-00 。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit

34 实验步骤 1. 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。 2. 测量 PCR 产物体积并将其转移至 1.5mL 离心管中， 加入 4-5 倍体积的 Buffer CP 。 3. 漩涡混匀，短暂离心收集管盖上液滴。 4. 把 HiBind DNA 柱子套在 2mL 收集管中。 5. 把 PCR/CP 混合液转移至 HiBind DNA 柱子中，室 温， 10000 ×g 离心 1min 。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit

35 6. 去除滤液，把柱子重新装回收集管中。若 PCR/CP 混匀液超过 700µL, 每次转移 700µL 至 HiBind DNA 柱子中，离心后重复 5-6 步至所有的 混匀液都从柱子中过滤完。 7. 转移 700µL DNA Wash buffer （已用乙醇稀释 ）至柱子中， 按上述条件离心。 注：使用前 DNA Wash buffer 必须用无水乙醇稀 释，并于室温保存。 8. 重复步骤 7 一次。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit

36 9. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管， 12000g 离 心空柱 2min 以甩干柱子基质。 注意：不要忽略此步 - 这对从柱子上除去乙醇至关 重要。 10. 把柱子装在一个干净的 1.5mL 离心管中，加入 30 µL 灭菌双蒸水到柱基质上，室温静置 2min ， 10000g 离心 1min 以洗脱 DNA 。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit

37 实验五 DNA 连接与 TA 克隆 实验目的 学习掌握 DNA 连接和 TA 克隆的技术与方法 实验原理 连接：线性 DNA 以共价键连在一起的过程。 TA 克隆：直接将 PCR 产物质粒载体的快速克隆方法。 PCR 产物末端不依赖模板而加上一个腺苷酸（ A ）， T 载 体的末端带有 T 。

38 载 体载 体 载体是运送目的基因片段进入宿主细 胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、 λ 噬菌体、 cosmid 质粒等。  质粒是细菌细胞中自然存在于染色体 外可以自主复制的一段环状 DNA 分子。进入 到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷 贝数。

39 载体的结构 1. 抗性基因（ Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 2. 启始复制子（ ori, Origin of replication) ； 3. 多克隆位点 (MSC, Multiple cloning site or polylinker) ； 4. 标记基因 (Marker gene, such as LacZgene) 。

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41 蓝白斑筛选原理 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特 征筛选重组子，如 α- 互补、抗生素基因等。带有 β- 半乳糖苷酶 基因（ lacZ ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点（ MCS ），它并不破 坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到 β- 半乳糖苷酶的氨基端 而不影响功能，这种载体适用于可编码 β- 半乳糖苷酶 C 端部分序 列的宿主细胞，因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性 ，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。 这样， lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整 近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为 α- 互补。

42 由 α- 互补而产生的 LacZ 细菌在诱导剂 IPTG 的作 用下，在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落，因 而易于识别，然而，当外源 DNA 插入到质粒的多 克隆位点后，导致无 α- 互补能力的氨基端片段， 使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重 组子的筛选，又称为蓝白斑筛选， 转化菌平板 37 ℃温箱倒置培养 12-16hr 后，有重组 质粒的细菌形成白色菌落。

43 T1 （ F ‐ φ80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74hsdR(rK ‐ mK+) ΔrecA1398 endA1 tonA ）为常规基因克隆中普遍使用 的菌株，倍增时间大约为 50 分钟，是当前生长速度最快的 大肠杆菌细胞。在氨苄抗生素平板上， 8-9 小时可见抗性 克隆。该菌还可以与表达 β 半乳糖苷酶 α 肽的质粒在 IPTG 和 X ‐ gal 存在下实现 α 互补，用于蓝白斑筛选。

44 连接反应 在微型离心管中依次加入溶液： PCR 产物 1 μL ( 根据 PCR 产物量可适当增减，最多不超过 4 μL ） pEASY- T1 Cloning Vector 1 μL 轻轻混合，室温 (22 ℃ -37 ℃ ) 反应 15 分钟。反应结束 后，将离心管置于冰上。 Trans pEASY-T1 Simple Cloning kit

45 转化 1. 加连接产物于 50μLTrans1-T1 感受态细胞中（在感受态 细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴 20- 30min 。 2. 42 ℃热激 30s ，立即置于冰上 2min 。 3. 加 250μL 平衡至室温的 LB ， 200 rpm ， 37 ℃孵育 1h 。 4. 取 8 μL ， 500 mM IPTG ， 40 μL ， 40 mg/ml X-gal 混 合，均匀地涂于准备好的平板上，在 37 ℃ 放置 30min 。 5. 待 IPTG ， X-gal 被吸收后，取 200μL 菌液铺板，培养过 夜（为得到较多克隆， 4000 rpm 离心 1 min ，弃掉部分 上清，保留 100-150 μL ，轻弹悬浮菌体，取全部菌液 涂板，培养过夜）。 Trans1-T1 Phage resistant Chemically Competent Cell

46 注意事项 ： 刚刚化冻的细胞，转化效率最高。 避免反复化冻。 避免用移液枪吹吸。 整个操作过程要轻柔。

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