PCR 污染的产生及防治 分子生物学技术平台讨论会 ——PCR 系列之一 2008-2-28. PCR 污染的监测 PCR 强大扩增能力 + 检测的敏感性 经 30 个周期后，特定 DNA 片段的数量在理论上可增加 10 9 倍 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC (No.

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1 PCR 污染的产生及防治 分子生物学技术平台讨论会 ——PCR 系列之一 2008-2-28

2 PCR 污染的监测 PCR 强大扩增能力 + 检测的敏感性 经 30 个周期后，特定 DNA 片段的数量在理论上可增加 10 9 倍 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板 DNA 但含有 PCR 系统中所有其他成分的对照 反应，这一对照管须在准备好所有其他 PCR 以后才进行吸加。

3 常见的 PCR contamination 常规 PCR 荧光定量 PCR NTC432176598

4 引起 PCR 污染的原因  模板间交叉污染 容器被污染 模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 模板吸取过程中, 因气溶胶（ aerosol ）或其他原因引起移液器污 染，从而导致交叉污染

5 引起 PCR 污染的原因  PCR 试剂污染 PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被 PCR 核酸模板污染。

6 引起 PCR 污染的原因  PCR 产物污染 - 最主要最常见 PCR 产物拷贝量大，极微量的 PCR 产物污染, 就可形成假阳性。 移液器吸取 PCR 产物进行电泳检测，同一支移液器去准备 PCR mix PCR 产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝 ※气溶胶（ aerosol ）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm 的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态 散体系。 空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈 地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可 形成气溶胶

7 引起 PCR 污染的原因  实验室中克隆质粒的污染 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂, 其污 染可能性也很大

8 防止 PCR 污染 首要原则 永远要设置 NTC 对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的 后果：一大段时间的数据不可信 准备 PCR 的移液器要专用 千万不能用吸取 PCR 产物 / 克隆质粒的移液器去准备 PCR 体系

9 防止 PCR 污染 空间： 合理分隔实验区域 : 将样品的处理、配制 PCR 反应液、 PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区进行， 特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤 严格分开。 理想状态： 各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区 域用紫外线消毒，破坏残留的 DNA 或 RNA 。

10 防止 PCR 污染 操作 一旦进入吸加 PCR 试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套， 并应勤于更换。 准备专供自己使用的 PCR 试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。 选择质量好的 Eppendorf 管 -- 密封性好且开管不需要太大力气 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作 要轻，以防管内液体溅出。 实验结束后及时清理台面

11 防止 PCR 污染 移液器操作 由于操作时不慎将模板吸入枪内 或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样时要十分小心。 1 ）准备 PCR 的移液器专用 2 ）吸样要慢，吸样时尽量一次性 完成，忌多次抽吸，切勿形成喷 雾，以免交叉污染或产生气溶胶 污染。 3 ）最好在加完所有其他反应成分 后才吸加模板。 4 ）推荐在准备 PCR 过程中使用滤 芯枪头

12 选用含 UNG （尿嘧 啶 DNA 糖基酶 Uracil-N- Glycosylase) 的试剂， 有助于防止 PCR 产 物引起的污染。 UNG ： 50 摄氏度， 2 分 钟，作用于含有 dU 的 DNA 双链或单链 然后开始 PCR 反应的预 变性步骤，同时 UNG 失活 防止 PCR 污染 ※对于不含 dU 的 PCR 产物无效

13 出现污染后解决办法 更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用 清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1 ）实验台面、超净工作台用现配的 3% 双氧水或 10% 次氯酸钠 溶液擦拭清洁。 2 ）或者用 10% 漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过 90 cm ，照射时间最好过夜。 实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法

14 参考文献 Kwok S,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J ]. Nature,1989,339 (6221) :237 - 238. Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top14

15 讨论 设置 -RT 对照后是不是可以不用设 NTC 了？ 使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？ ……