蛋白质复性（二）. 本章内容 包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣.

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1 蛋白质复性（二）

2 本章内容 包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣

3 本章重点 蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用

4 1 包含体的分离纯化 从细胞破碎开始，常采用机械破碎、化 学裂解、酶解或联用 离心沉降是常用的分离手段 膜分离也可以用于包含体的分离回收 用适宜的缓冲液对包含体进行洗涤

5 分离纯化注意事项 包含体的纯度对于复性收率影响显著 （包含体的纯度对复性收率的影响？） 对于特定的表达系统和表达产物，需根 据具体情况进行纯化过程开发实验，确 定适宜的纯化方案

6 2 包含体分离纯化的一般过程 细胞破碎 离心沉降回收包含体 包含体 的洗涤（ EDTA 、低浓度的变性剂或表面活 性剂，溶解膦脂、膜蛋白质） 离心沉降回收包含体 可反复进行洗涤、离心回收

7 3 包含体的溶解 溶解目的：使目标蛋白质肽链伸展，为进一步 复性创造条件 利用高浓度的强变性剂，像 6-8mol/L 盐酸胍 或 8mol/L 尿素 ( 盐酸胍好于尿素 ) 、硫氰酸盐 表面活性剂： SDS ，十六烷基三甲基氯化胺 还原剂： DTT ， β- 巯基乙醇，半胱氨酸 螯合剂：清除重金属离子，消除氧化作用

8 4 蛋白质复性 （了解） 1961 年， Anfinsen 发现，在自由能驱动下， 变性后的牛胰核糖核酸酶 (RNase A) 可在体外 通过空气氧化自发形成正确的二硫键。 提示了蛋白质一级结构和高级结构的关系。 蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部 信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自 发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性 剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折 叠复性。

9 蛋白质复性 氧化复性：对于含二硫键的蛋白质，需 要添加氧化剂和还原剂，调节复性液氧 化还原环境，促进正确二硫键的形成。 通常在弱碱性 (pH=7.5-9.5) 缓冲液中进 行，有利于硫醇阴离子的形成，促进二 硫键的形成和交换。

10 5 常用的氧化 / 还原剂 GSSG/GSH 胱氨酸 / 半胱氨酸 在 Cu 2+ 存在下的空气氧化

11 6 复性折叠过程假说 从低级结构到高级结构的逐步演化的 “ 完 美 ” 假说 塌陷 — 调整 — 折叠 （ “ 塌陷 ” 假说）

12 7 蛋白质复性过程 可借助简化的竞争反应动力学模型 表示 N A UI 折叠过程中的中间态是 20 世纪 70 年 代蛋白质折叠研究的一个重大突破。

13 蛋白质复性的主要挑战就是创造适宜的 复性条件，最大程度地抑制聚集体的生 成，提高复性收率。 包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、 经验性很强的工作。

14 8 稀释复性 最简单，最常用，传统方法 具体模式：直接稀释复性、透析复性、 流加复性 1 ）直接稀释复性：将变性蛋白质溶液直 接稀释到适宜的复性缓冲液中

15 稀释复性动力学 （了解思路） 根据竞争反应动力学模型，可以列出稀 释复性动力学方程 蛋白质复性收率： N/U 0 蛋白质复性收率随浓度提高而降低 主要是通过降低变性蛋白质的浓度来实 现

16 2 ）流加复性方法 将变性蛋白质分多批次加入到复性液中， 或采用连续流加到复性液中 在复性液中变性蛋白质浓度 ( 折叠中间体 ) 浓度始终保持在较低的水平

17 直接稀释复性 & 流加复性 （异同）

18 9 辅助因子的作用 在稀释复性中添加各种小分子溶质，以 抑制聚集体的生成 又称 “ 稀释添加 ” 复性

19 添加剂辅助蛋白质复性的机理 1. 稳定天然态蛋白质的结构，降低错误 折叠蛋白质的稳定性 如甘油 2. 提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度 ( 稳定性 ) 如低浓度变性剂、聚乙二醇（ PEG) 、表面活 性剂

20 辅助蛋白质复性的稀释添加剂 分类物质名称 低浓度变性剂盐酸胍 (0.5-2mol/L) 尿素 (1-4mol/L) 氨基酸 L- 精氨酸 表面活性剂聚乙二醇 Triton X-100 十二烷基磺酸钠 十六烷基三甲基溴化胺 月桂醇麦芽糖苷 吐温 磷脂

21 辅助蛋白质复性的稀释添加剂 分类物质名称 糖类蔗糖 葡萄糖 Β- 环糊精 乙酰葡萄糖胺 醇类甘油 正戊醇 正已醇 环已醇 其他有机小分子化合物三羟甲基氨基甲烷 丙酮 乙酰胺 肌氨酸 硫脲 硫化甜菜碱 无机盐硫酸铵，氯化锂，氯化钠，硫酸钠，硫酸钾

22 使用稀释添加剂需注意的问题 选择性，如聚乙二醇可辅助碳酸脱水酶复性，但对 溶菌酶复性无影响 最佳浓度范围，对于稳定折叠中间体或伸展肽链的 添加剂，其辅助作用在一定浓度范围有效 复性剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度 有关 常需更长的复性操作时间

23 选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中， 若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通 过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效 果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添 加剂。 表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。

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