免疫组织化学实验技术 杨飞 武汉大学基础医学院 病理与病理生理学系. 武汉大学病理教研室 免疫组织化学技术的定义 免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC) 是用标记的特异性抗体（或抗原）对 组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、 定性、定量检测，经过组织化学呈色反应.

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1 免疫组织化学实验技术 杨飞 武汉大学基础医学院 病理与病理生理学系

2 武汉大学病理教研室 免疫组织化学技术的定义 免疫组织化学技术 (Immunohistochemistry, IHC) 是用标记的特异性抗体（或抗原）对 组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、 定性、定量检测，经过组织化学呈色反应 在组织原位显示抗原（或抗体），如各种 蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门 新技术。

3 武汉大学病理教研室 免疫组织化学的应用 IHC 通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的 正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常 生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛 用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测， 细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、 细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信 号转导的研究等。

4 武汉大学病理教研室 实验内容 链霉菌亲和素 - 过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称 S-P 法 ) 检测胃癌组织 CK ／ Vimentin 的蛋白表达

5 武汉大学病理教研室 S-P 法原理示意图 过氧化物酶 链酶亲和素 生物素 生物素化二抗 特异性一抗 待测抗原

6 武汉大学病理教研室 免疫组织化学基本实验流程 组织、细胞标本抗原修复阻断内源性过 氧化物酶 正常血清封闭滴加特异性一抗滴加二抗 滴加三抗显色复染 封片

7 武汉大学病理教研室 实验步骤 实验步骤 1 ．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以 0.01M PBS （ pH 7.4 ）漂洗 3×5min ； 2 ．所有组织均采用微波修复抗原； 3 ．室温冷却后， 0.01M PBS （ pH 7.4 ）漂洗 3×5min ； 4 ．滴加 50μl 过氧化物酶阻断液（试剂 A ）， 37 ℃湿盒孵 育 10min ； 5 ． 0.01M PBS （ pH 7.4 ）漂洗 3×5min ； 6 ．滴加非免疫性动物血清（试剂 B ）， 37 ℃湿盒孵育 10min ；

8 武汉大学病理教研室 7 ．甩去多余血清，分别滴加２种抗体， 4 ℃湿盒孵育 过夜， 0.01M PBS （ pH 7.4 ）漂洗 3×5min ； 8 ．滴加生物素标记的二抗（试剂 C ）， 37 ℃湿盒孵育 15min ， 0.01M PBS （ pH 7.4 ）漂洗 3×5min ； 9 ．滴加链亲和素 - 过氧化物酶溶液（试剂 D ）， 37 ℃ 湿盒孵育 15min ，甩去多余液体； 10 ．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（ DAB ）显色 液，光镜下控制反应时间（约为 1-5min ），自来 水充分冲洗，苏木素复染； 11 ．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12 ．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用 PBS 取代第一抗体，其余步骤相同。

9 武汉大学病理教研室 实验流程中的注意事项 内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染

10 武汉大学病理教研室 染色前处理 － 取材、脱水、浸蜡 组织及时固定 固定剂选择： 10% 中性缓冲福尔马林 4% 多聚甲醛 常规下固定 8 ～ 24 小时 取材厚度： 2 mm

11 武汉大学病理教研室 染色前处理 － 预防脱片 常选用多聚耐氨酸（ poly-L-lysine ） 注意： 1 ）应严格控制使用次数 2 ）玻片洁净度

12 武汉大学病理教研室 染色前处理 － 包埋与切片 包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过 62 ℃ 切片：厚度 3-4μm 烤片：温度 60 ℃，时间 1 小时；或 60 ℃ 2 小时 （迈新）；或 60 ℃过夜

13 武汉大学病理教研室 染色前处理 － 切片保存 切片不宜长时间在常温下保存 染色前处理 － 脱腊 原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规 HE 脱蜡分开

14 武汉大学病理教研室 实验操作中的应用 抗原修复 实验操作中的注意事项

15 武汉大学病理教研室 抗原修复 影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1 ）酶消化法 2 ）加热法（高压法 › 水煮法 › 微波法） 抗原修复液的选择 1 ）柠檬酸盐缓冲液（ PH 7.2-7.4 ） 2 ） Tris （ PH 7-8 ） 3 ） EDTA （ PH 8.0 ）

16 武汉大学病理教研室 内源性过氧化物酶的灭活 存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞 消除方法： 3% H 2 O 2 浸泡 10 分钟

17 武汉大学病理教研室 血清封闭 目的：减少非特异性着色 时间：一般在加载一抗之前使用

18 武汉大学病理教研室 冲 洗 一般采用 PBS （ PH 7.4-7.6 ）充分冲洗 增加效果 可加入 Tween20

19 武汉大学病理教研室 一抗孵育时间及抗体选择 应选择信誉高、质量好的试剂公司 抗体切忌反复冻融 一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 按说明书可采用 37 ℃ 1-2 小时或 4 ℃ 冰箱过夜

20 武汉大学病理教研室 检测及显色系统 一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基 础的检测方法。如 SP 、 LSABC 、 ABC 等 显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测

21 武汉大学病理教研室 显色系统 常用的酶 1. 辣根过氧化物酶 (HRP) A: 显色底物 DAB----- 棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B: 显色底物 AEC----- 砖红色 2. 碱性磷酸酶 (AP) 显色底物 :BCIP/NBT---- 蓝紫色

22 武汉大学病理教研室 复 染 原则：注意两者之间对比，突出阳性信号

23 武汉大学病理教研室 实验对照设计 原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照 编号阳性片待检片阴性对照结论 1 －－－操作失误，抗体失效 2 ＋＋＋非特异性着色 3 －＋－阳性片不含靶抗原 4 ＋－－待检片不含定位抗原 5 ＋＋－待检片含定位抗原

24 武汉大学病理教研室 结果分析 1. 特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。 CK10 CD44v6 ER

25 武汉大学病理教研室 2. 染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分布； 染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多少。 人肝癌中 EGFR 的表达

26 武汉大学病理教研室 3. 颗粒性显色 DAB 显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。 人肺癌组织中 P63 的表达

27 武汉大学病理教研室 4. 避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。 坏死组织着色： AE1/AE3

28 武汉大学病理教研室 嗜酸性粒细胞中细胞色素显色 吞噬细胞内 含铁血黄素