拓宽思维，寻找尿液中的宝藏 解放军总医院 肾脏疾病国家重点实验室 吕杨 2014-5 北京. 主要内容 1. 尿液中到底有什么宝藏？ 2. 如何拓宽思维，寻找尿液中的宝藏？

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1 拓宽思维，寻找尿液中的宝藏 解放军总医院 肾脏疾病国家重点实验室 吕杨 2014-5 北京

2 主要内容 1. 尿液中到底有什么宝藏？ 2. 如何拓宽思维，寻找尿液中的宝藏？

3 一、尿液的组成 尿液 上清 尿沉渣 ？ ？

4 目前常见的尿沉渣中所含的物质 有机 成分 细胞红细胞、白细胞、上皮细胞、泌尿系统肿瘤细胞 管型透明管型、红细胞管型、白细胞管型、上皮细胞 管型、脂肪管型、颗粒管型、蜡样管型 其他粘液丝、类管型、脂肪球、细菌、真菌、寄生虫、 精子、外界混入物 无机 成分 结晶盐类结晶（含非晶形盐类）：尿酸盐、磷酸盐、 草酸钙等 病理结晶：胆红素、胆固醇、胱氨酸、亮氨酸等 药物结晶：磺胺类、解热镇痛剂、放射造影剂 （一）尿沉渣 红细胞管型肾小管上皮细胞 扁平细胞尿酸盐结晶

5 （ 1 ）最新发现的尿沉渣中的细胞 干细胞群（ USCS)——IPSC Zhou T, Benda C, Duzinger S,et al. JASN ， 2011 Jul; 22 (7 ):1221-8. Lang R1, Liu G, Shi Y, et al. Plos one 2013;8(1):e53980. 足细胞 干细胞获取新 途径 肾小球滤过屏 障的标志物 提示： 1. 目前发现尿液中的细胞主要来源与泌尿系统 2. 但是，并不能排除其它来源的细胞，例如干细胞的发现 3. 因此，仍然有必要对尿液中的细胞成分进行分析！

6 （ 2 ）尿沉渣中的核酸成分  DNA – 甲基化 6 methylation markers (MYO3A, CA10, SOX11, NKX6-2, PENK and DBC1) 膀胱癌 诊断 GSTP1 甲基化 前列腺癌  mRNA podocine\ podocyte marker TNKS-1 与膀胱癌的分期及预后相关。 PCA3 可以用于前列腺癌的诊断 The long non-coding RNA SChLAP1 前列腺癌的转移 - 进展诊断  miRNA 糖尿病肾病伴肾小球硬化： miR-15 下降 IgA 肾病 miR-17 表达上升 Gelmini S Gelmini S 1, Quattrone S, Malentacchi F, et al, Clin Chem Lab Med. 2007;45(7):862-6.Quattrone SMalentacchi F Clin Chem Lab Med. Szeto CC, Ching-Ha KB, Ka-Bik L ， et al. Dis Markers. 2012;33(3):137-44. Dis Markers. 既然有细胞，就会有细胞内包含的核酸。 提示：甲基化 DNA 、 RNA 也主要来源于尿沉渣 的细胞中，这些细胞大部分来自泌尿系统以及 前列腺。至于其他器官的疾病或者癌症，由于 脱落细胞很难进入泌尿系统，因此，检测它们 的 DNA 或者 RNA 比较困难。但是，这并不能排 除这些细胞是否存在。

7 （二）尿上清 常见的 有机物：葡萄糖、酮体、蛋白质 无机物 尿酸、胆红素等

8 利用质谱找到的尿上清中的蛋白质 1997 Heine G 鉴定出 34 个高丰度蛋白 2002 Thongboonkerd V 分离鉴定出正常人尿液的 67 种蛋白及亚型 2004 Pieper R 采用免疫亲和扣除色谱技术去除高丰度蛋白，质谱技术鉴定出正常尿 液中 150 种蛋白质 2006 Adachi J 应用 LTQ-FT 技术鉴定出正常尿液的 1534 种蛋白 2009 Alex K 应用 LTQ-Orbitrap 质谱与 LC-MS 质谱联用技术鉴定出 2362 种蛋白 2009 Kim KH 应用 nLC-ESI-MS-MS 技术纯化鉴定出 245 种蛋白，新发现 110 种 我们最近与高友鹤、孙伟教授团队合作，可以发现正常人尿液中接近 1500 个蛋白质 （ 1 ）新发现的蛋白质

9 利用 ELISA 、蛋白质芯片其它技术找到的尿液中蛋白质 细胞因子 - 免疫炎症因子、粘附因子（ TGF-beta 、 ICAM1 、 CCL2 、 IL-2 、 IL-18 ） 肾损伤因子 -KIM1 、 Cystatin C Urinary Protein Biomarker Database Urinary Protein Biomarker Database 记录了目前尿液中有许多潜在的标志物

10 主要问题 1. 虽然经过了多年的研究，上述发现的蛋白质仍然缺乏特异性。 2. 尿液的蛋白质谱多为高丰度蛋白质，低丰度蛋白质较少，导致研究局限 3. 尿液蛋白质变化与疾病发病机制联系并不紧密，无法建立证据链条。 怎么办？

11 （ 2 ） circulating nucleic acids Allen KC Chan, Rossa WK Chiu and YM Dennis Lo, Ann Clin Biochem 2003; 40: 122–130

12 Plasma/serum nucleic acids as a tumour marker Bettegowda CBettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al, Sci Transl Med. 2014 Feb 19;Sausen MLeary RJ Sci Transl Med. 除了与肿瘤相关， circulating nucleic acids 还与胎儿染色体异常以及创伤相关。 目前研究表明，尿液中也存在 circulating nucleic acids 。这是一个有待开发的宝藏，

13 （ 3 ）尿液中微囊泡 微囊泡 (microvesicle) ，近些年作为一种新的细胞传递途径逐渐引起人们广泛关注。 它主要分为两种，包括外质体（ Exosomes ）和微粒体（ Micropaticles, MPs ）。 外质体是由细胞多泡体 (Multivesicular bodies ， MVB) 形成并分泌到细胞外的膜性 小囊泡，直径为 40 ～ 100nm ；微粒体直接由胞浆膜以出芽方式脱落而释放，直径 100 ～ 1000nm 。细胞 - 细胞间信息传递可以通过多种机制完成，包括受体 - 配体结合、 相邻细胞的直接接触、细胞 - 细胞突触联系等。 微囊泡的发现和研究，为细胞间信号传导和信息传递提供了一种新的途径。

14 微囊泡功能 微囊泡的生物学作用起初未受到重视，曾被认为是细胞碎片，仅是细胞活化或损伤的标志物。 越来越多的研究发现微囊泡具有重要的生物学作用，可以与邻近或远处的细胞相互作用，传递 生物信息。微囊泡与靶细胞有多种作用方式，主要表现为以下几种： （ 1 ）通过其表面的配体与靶细胞的受体结合继而激活或抑制靶细胞内的转导通路。 （ 2 ）传递母细胞的蛋白质或 mRNA 到靶细胞。微囊泡在形成过程中可以将母细胞质中的成分 ( 蛋白质、 mRNA 或 miRNAs) 包裹进去，然后传递到靶细胞中，使其具有新的生物学功能或 遗产特征。 （ 3 ）将母细胞膜的受体转移到靶细胞而呈现相关受体表型。 （ 4 ）作为载体转移完整的细胞器或致病因子。 G. Camussi, M. C. Deregibus, S. Bruno, V, et al, Kidney Int, 2010,78 (9): 838-848 E. van der Pol, A. G. Hoekstra, A. Sturk, C, et al,. J Thromb Haemost, 2010, 8 (12): 2596-2607 ．

15 尿液微囊泡超微结构 从正常人尿液微囊中分离出 微囊泡，透射电子显微镜下 观察，可见具有明显异质性 的圆形或椭圆形小囊泡，平 均直径大小在 40 ～ 150nm ， 有完整的包膜，内为低电子 密度物质。

16  近年来大量的研究着重于尿液 exosomes 的蛋白质组学分析，已证实它们含有肾脏 和泌尿道来源的细胞特异性蛋白 / 转运蛋白，能作为可靠的生物标记物  此外，除了蛋白质和肽类，研究证实尿液 exosomes 中含有 mRNA 和 miRNAs 成 分，这些 RNA 也能够作为肾脏疾病的潜在生物学标记物 T. Pisitkun, R. F. Shen,M. A. Knepper.. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101 (36): 13368- 13373 ． K. C. Miranda, D. T. Bond, M. McKee, J ， et al. Kidney Int, 2010, 78 (2): 191-199 ．

17 二、如何拓宽思维，寻找尿液中的宝藏？ 1. 扩大尿液成分检测范围，结合病变组织成分研究，提高尿液 生物标志物的组织特异性。 （ 1 ）游离核酸、微囊泡等。 （ 2 ）低丰度蛋白质 （ 3 ）其它代谢物 尿液中不论是核酸、蛋白质，还是有机物，都是反映人体各种生命 活动的指标！也是生物标志物的来源！

18  1. 无创诊断 以肿瘤为例，刚发现时、放疗化疗后、靶向药物使用后，同一种肿瘤的基因型会发生明显 的改变。通过及时分析尿液中游离 DNA 、肿瘤细胞 DNA 的基因型，就会提早发现肿瘤的耐药性， 从而在肿瘤指数生长前，及时更换治疗方案。  2. 病情发展检测 以肾脏病为例，激素和免疫抑制剂是常用药物，其主要作用是抑制免疫激活。但是在临床 实践中，由于缺乏判断免疫激活的指标。只能根据经验用药，即使机体免疫功能显著抑制了， 仍然用药，导致非常多的副作用。如果可以检测尿液中细胞因子的变化，就可以辅助医生进 行正确判断，从而指导用药 2. 结合临床实际，开发尿液标志物的新用途

19 3. 建立系统生物学思维，综合不同类型的生物标志物，解决迫切的临床问题，指 导精准治疗 患者 诊断 治疗 预后 血液尿液 组织穿刺 以肿瘤研究为例，血液中的肿瘤标志物结合临床检查已经可以帮助我们进行诊断了，但是，目前缺乏肿 瘤转移的生物标志物，这就是迫切需要解决的临床问题。如果我们可以开发肿瘤转移的标志物，对于治 疗和预后均有重要意义。 已知的 标志物 开发的 标志物 +

20 致谢 肾脏疾病国家重点实验室 陈蕾 任怡 陈曦曌 肖枫林 提供的帮助 谢谢各位专家指导！