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荧光原位杂交实验 F luorescence In Situ Hybridization
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原位杂交 (In situ hybridization) 1 ）同位素原位杂交 (Isotopic in situ hybridization) ——70 年代 2 ）非同位素原位杂交 (Non-isotopic in situ hybridization) ——80 年代中后期 （ 1 ）免疫酶联 （ 2 ）荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization, FISH) ** 同位素原位杂交的不足之处： 1 ）不稳定； 2 ）高背景； 3 ）曝光时间长； 4 ）结果统计学处理繁琐。 5 ）同位素的使用和处理
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实验的基本原理 : FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy.
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DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.
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** 荧光原位杂交的特点： 1 ）快速； 2 ）信号强； 3 ）特异性高； 4 ）多色。 **FISH 有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质：（ 1 ）生物素 (biotin)/ 地高辛 (digoxigenin) —— 半抗原报告分子（间接标记） （ 2 ）荧光物质（直接标记）
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FLUORESCENT labeled dUTP HAPTENE labeled dUTP AMCA-6-dUTP CascadeBlue-4-dUTP Fluorescein-12-dUTP Rhodamine-6-dUTP TexasRed-6-dUTP Cy3-6-dUTP Cy5-dUTP Biotin(BIO)-11-dUTP Digoxygenin(DIG)-11- dUTP Dinitrophenyl (DNP)-11- dUTP
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染色体复染的物质 : Propidium Iodide (PI) （红色） DAPI （兰色） quinacrine （绿色） chromomycine A3 （绿色）
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染色体 “ 原位抑制 ” 杂交（ chromosome in situ suppression, CISS) 克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针 中加入过量的未标记的竞争性 DNA(competitor DNA) ，如 human Cot-1 DNA ，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞 争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物 中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。 **FISH 技术的应用 1 ）基因（或 DNA 片段）的染色体定位； 2 ）染色体数目与结构异常的检测； 3 ）间期细胞遗传学（绒毛 / 羊水 / 精子 / 卵裂球 / 其它间期细胞研究与 诊断）； 4 ）肿瘤遗传学研究
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** 用于 FISH 的探针 1 ）单拷贝探针： （ 1 ）种类： YAC ， BAC ， Cosmid ， Plasmid ， cDNA 片段 （ 2 ）应用 （ a ）定位 DNA 片段及嵌合体克隆验证； （ b ）确定染色体微小缺失与重复； （ c ）染色体断裂点分析。 （ d ）间期细胞染色体数目异常诊断。
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DNA 片段的染色体定位
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FISH 检测微小缺失
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染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1
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21q22.2 BAC 克隆在 Down 综合征间期细胞中的杂交信号
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２）简单重复序列探针 (simple repetitive probes) —— 异染色质着丝粒探针 (heterochromatic centromer probes) 其靶序列为 α 卫星 DNA 或卫星 III DNA(alpha satellite/satellite III DNA) 多位于染色体的着丝粒和异 染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用： (a) 标记染色体识别 (b) 染色体数目异常检测 (c) 间期细胞遗传学研究和临床诊断
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** 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十 分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。 人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养 获得中期染色体分裂相，间期 FISH 为这一时期 遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。
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３）染色体涂染探针 (chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针 探针来源： （ 1 ）含有人单条染色体的人 - 啮齿类 (human-rodent) 体细胞杂 种组织融合的产物； （ 2 ）荧光激活的流式细胞仪 (fluorescence-activated cell sorter,FACS) 分离整条染色体 DNA ，并以载体克隆 /PCR 扩 增； （ 3 ）显微切割得到染色体或染色体片段， PCR 扩增； 应用 （ 1 ）染色体数目和结构异常分析； （ 2 ）不同物种间的同源性比较； （ 3 ）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
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多色 FISH （ muti-color FISH) 多色复合染色体 FISH 探针 (multiplex FISH, M-FISH probes) # 两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统， 通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针 后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
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实验的基本操作步骤及时间安排 一 淋巴细胞的培养及染色体标本制备 第一天（星期一）采血、接种（ 10:00 ） 第二天（星期二）培养 第三天（星期三）培养 第四天（星期四）上午 7:00 加秋水仙素,( 终浓度 0.2ug/ml ） 至上午 10:00 结束培养 制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。将选好的 标本放入 50 ℃烤片。
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第五天（星期五） 探针变性： 75 ℃水浴 5 分钟，立即置于 0 ℃（冰浴中） 5-10 分钟。 玻片标本变性： 1. 50 ℃温箱中 2 小时 2. 标本在 70-75 ℃， 70% 甲酰胺 /2XSSC 中变性 2-3 分 钟。 3. 立即脱水， 70-90-100% 顺序，各 5 分钟。 4. 室温干燥
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原位杂交： 将变性的 DNA 探针 10ul 滴于变性并脱水的 玻片标本上，盖上盖玻片， Parafilm 封片， 置于湿盒中 37 ℃杂交过夜。（ 15-17hr ） 第五天实验结束
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( 第六天，星期六 ) 洗脱、信号放大和免疫荧光检测 1. 用刀片将盖片揭起，轻轻移掉。 2. 45 ℃ 50% 甲酰胺 /2XSSC 中洗 3 次，每次 5 分钟。 3. 45 ℃ 1XSSC 中洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 室温下， 2XSSC 轻洗一下。 5 加 180ul 封闭液 I ，以薄膜盖片， 37 ℃温育 20 分钟 ，加入 180ul avidin-FITC,37 ℃温育 45 分钟。 6. 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中洗 3 次，每次 5 分钟。
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7 加封闭液 II,37 ℃温育 20 分钟。 8 加 180ul antiavidin 于标本上， 37 ℃ 45 分钟。 9 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中 洗 3 次，每次 5 分钟。 10 加 180ul 封闭液 I ， 37 ℃温育 20 分钟。 11 加 180ul avidin-FITC ， 37 ℃温育 45 分钟。 12 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中洗 2 次，每次 5 分钟。再于 2XSSC 室温轻洗一下。
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13 将玻片自然干燥， PI/antifade 复染，盖上盖片。 14 镜检、照相。
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