经典免疫技术. 实验目的要求 1 、掌握直接凝集反应、沉淀反应的原理和 操作方法 2 、熟悉斑点免疫层析试验的原理和操作方 法 2 、熟悉斑点免疫层析试验的原理和操作方 法.

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1 经典免疫技术

2 实验目的要求 1 、掌握直接凝集反应、沉淀反应的原理和 操作方法 2 、熟悉斑点免疫层析试验的原理和操作方 法 2 、熟悉斑点免疫层析试验的原理和操作方 法

3 一、凝集反应 为一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原 微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电 介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼 可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝 集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应 和间接凝集反应两类。 （一） （一）实验原理

4 —— 直接凝集反应（原理） 颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结 合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。 （ 1 ）玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检 测未知抗原。可用以菌型、 ABO 血型等的鉴定。 （ 2 ）试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗 原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来 协助临床诊断或供流行病学调查研究。诊断伤寒、副 伤寒病的肥达反应均属定量凝集反应。 + 

5 （二）材 料 标准抗 A 、抗 B 诊断血清；受测者红细胞、 盐水、采血针、棉球、玻片等。 待测细菌纯培养物，标准诊断血清

6 （三）方 法 1 、直接凝集反应测血型 （ 1 ）取一块清洁玻片，用记号笔划上记号，左上角写 A 字，右上 角写 B 字。 （ 2 ）用小滴管吸 A 型标准血清（抗 B ）一滴加入左侧，用另一小 滴管吸 B 型标准血清（抗 A ）一滴加入右侧。 （ 3 ）穿刺手指取血，玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌， 使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。 （ 4 ）静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显微 镜观察。 注意事项： （ 1 ）采血时要尽量避免用力挤压手指或耳垂，以免发生溶血影 响结果。 （ 2 ）如肉眼观察难以辨认，可使用显微镜观察凝血现象。

7 操作流程

8 2 、直接凝集反应细菌菌型测定 （ 1 ）取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，在一侧 滴加标准的诊断血清一滴, 另一侧滴加一滴生理盐水。 （ 2 ）用接种环无菌操作取适量的待测细菌, 分别与标准 诊断血清和生理盐水混均。 （ 3 ）静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察， 也可显微镜观察。 注意事项： （ 1 ）生理盐水、诊断血清要适量； （ 2 ）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后 放入消毒缸内； （ 3 ）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与 生理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则 影响结果观察。

9 （四）结果判断

10 二 、沉淀反应（双向琼脂扩散试验） 又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反 应。 将可溶性抗原和相应的抗体加入到琼脂板上对应的孔 后, 两者各自向四周扩散, 当浓度比例合适, 则经一定时 间后, 在加有抗原和抗体的两孔之间出现清晰致密的 白色沉淀线。 沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、 扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系时， 会出现多条沉淀线。 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓 度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。 （一）实验原理

11 （二）材料 玻片、琼脂糖、抗原、抗体（ 0 ； 1:2 ； 1:4 ； 1:8 ； 1:16 ）、微量加样器、滴管、湿盒、 水浴箱等。

12 （三） 操作步骤 1. 制板：将溶化的 1.5% 琼脂 3.5-4ml 倒在载玻片上，使 之能将表面覆盖，制成厚度约 2 ～ 3mm 厚的琼脂糖凝 胶板。 2. 打孔 : 待冷却后根据所需形状打孔, 孔径为 4mm 。孔间 距离为 4mm-5mm; 琼脂玻板的制备梅花型打孔图。 3. 加样 : 用微量加样器取 Ag10uL 加入中央孔 ; 将抗体进行 倍比稀释, 稀释度分别为, 1:1 （原液）； 1:2;1:4;1:8;1:16, 每个稀释度取 10uL 加入外围抗体孔 中。 4. 扩散 : 置湿盒 37 ℃, 24 小时观察结果

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14 每孔加入 抗原 / 抗体 10μl 注意事项 （ 1 ）打孔时，不要将琼脂划破； （ 2 ）加样时，不要溢出孔外； （ 3 ）加样用的吸管不要混用。 Ag 0 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 Ab AbAb

15 （四） 结果记录

16 三、胶体金标记技术 用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未 知抗原或抗体的技术。 （一）原理  以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本 后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包 被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物的显色 （ >20nm 的胶体金颗粒呈砖红色）达到检测目的。  根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤试验和胶体 金斑点免疫层析试验。

17 胶体金斑点免疫层析试验  将各种反应试剂 ( 抗体 ) 附着在硝酸纤维素膜 条上，检测时将待检标本加在膜条的一端， 使膜条上的胶体金标记抗体溶解后，与标 本中的待测物质反应形成 IC ，并通过毛细 管作用在膜条上渗滤、移行，再与膜上另 一种抗体反应，再后被截留、聚集在膜条 的一定区域，形成有颜色的反应条带。

18 C区C区 T区T区 吸水区 抗小鼠 IgG 抗体 ( 固定 ) 抗 α-HCG 抗体 ( 固定 ) 胶体金 - 抗 β -HCG ( 小 鼠 IgG, 游离 ) 用鼠抗 α-HCG 单克隆抗 体（测试区 ——T 区）和 兔抗鼠 1gG 多克隆抗体 （参照区 ——C 区）分别 固相硝酸纤维膜和胶体金 标记的抗 β-HCG 单克隆 抗体（吸水区）及其他试 剂制成，应用层析式双抗 体夹心法的原理检测尿液 中 HCG ，用于妊娠早期 辅助诊断。 临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂条

19 （二）材料 待检尿液、早早孕试验条 （三）方法 将早早孕试验棒的吸水区浸入待检尿液中 3~5 秒，勿超过 “ max ” 线 取出试验条放置于干燥、不吸水的平面上， 置 4~5 秒后观察结果

20 阳性阴性无效 HCG(+) HCG(-) 结论 : （四） （四）实验结果 (3 种可能 )

21 （五）结果分析 人绒毛膜促性腺激素（ HCG ）是受孕妇女 体内产生的一种糖蛋白类激素，在受孕妇 女血液和尿液中大量存在。卵子受精后第 6 天开始分泌 HCG ，一般 11 天后可以测出, 早 期妊娠时 HCG 的分泌量增加很快，约 1.7-2 天增加一倍, 而正常非怀孕妇女尿液检测不 到 HCG 。所以，检测尿液中 HCG 是判定妊 娠的可靠指标。

22 C区C区 T区T区 吸水区 抗小鼠 IgG 抗体 ( 固定 ) 抗 α-HCG 抗体 ( 固定 ) 胶体金 - 抗 β -HCG ( 小鼠 IgG, 游离 ) 下端浸入尿液 HCG 虹吸作用 HCG 上行与吸 水区的金标抗体结合, 并 上行至 T 区,HCG 又与抗 α-HCG 抗体结合 --- 双抗 体夹心法 C区C区 T区T区 抗 α-HCG + HCG + 胶体金 - 抗 β-HCGT 区红线 C 区红线 抗小鼠 IgG + 胶体金 - 抗 β-HCG

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