内毒素、 1 ， 3-β- 葡聚糖和 降钙素原检测的临床应用 安徽省立医院 检验科 戴媛媛. 内毒素概述 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结 构中的脂多糖（ LPS ），这些成分只 在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或 活菌以发泡形式将其释出。

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1 内毒素、 1 ， 3-β- 葡聚糖和 降钙素原检测的临床应用 安徽省立医院 检验科 戴媛媛

2 内毒素概述 内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结 构中的脂多糖（ LPS ），这些成分只 在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或 活菌以发泡形式将其释出。

3 外层 菌体多糖（ O 抗 原），与细菌侵袭 力有关。 中层 同一种属之间是相 同的。 内层 特殊的糖磷脂，起 毒性作用，而无种 属特异性。 特异性多糖 核心多糖 类脂 A 内毒素的结构

4 发热反应 1 激活血管活性物质的释放 2 激活凝血和纤溶系统 3 内毒素的生物学活性

5 直接或间接损害肝脏 5 激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统 6 内毒素的生物学活性 激活补体 4

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7 内毒素的有益作用 增加机体非特异性免疫力 1 防御放射性损伤，促进粒细胞生成 2 增加网状内皮系统功能 3 抗肿瘤，免疫佐剂作用 4

8 内源性 内毒素血症 外源性 内毒素血症产生原因 肠道内毒素的吸收 1 败血症时血中细菌的释放 23 有效的抗菌治疗后，细菌崩解 输入了含有 细菌的药物、 血液或者体 液等。

9 内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素 的抵抗力。症状和体征有：发热，白细胞数变化， 出血倾向，心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神 经系统症状，以及休克、血压下降、组织灌流不足、 缺氧及酸中毒等。 内毒素血症的临床症状 最严重的后果：致 死性感染性休克， 多器官功能衰竭， DIC 等。病死率极 高。

10 肺炎 100% 、尿路感染 70-80% 、腹腔感 染 72-84% 、烧伤 85% 、急性胰腺炎 90% 、败 血症 70% 、急性肝炎 37-64% 、暴发性肝炎 58-100% 、丙肝 61.54% 、胆石症伴急性梗阻 性化脓性感染 85% 、多器官功能衰竭 100% 。 各类疾病内毒素血症的发生率

11 内毒素检测的临床应用 在肝胆疾病中的应用 1 在呼吸系统感染中的应用 2 在胰腺疾病中的应用 3 在溃疡性结肠炎中的应用 4 在全身性细菌感染中的应用 5 在不明原因发热中的应用 6

12 内毒素检测在医院中的应用 在医院灭菌制剂检验中应用 1 对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测 2 在透析站和血站中的应用 3 在临床医学研究中的应用 4

13 鲎试验是 1968 年由 Levin 和 Bang 建立。 其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒 素产生凝集反应的现象，作为判断试品 中细菌内毒素含量的一种方法。 内毒素的检测方法

14 背面观 就像是古代武士的心甲 腹面观 腹部基本呈六角形， 还可以看到它发达的附肢

15 内毒素的检测原理 G G

16 内毒素的检测方法 鲎试剂（ Limulus amebocyte lysate LAL) 凝胶法 ——0.03EU/ml 范围内半定量 1 浊度法 ——0.006-300EU/ml, 检测范围大 2 比色法 ——0.006-15EU/ml 范围内定量 3 ELISA——0.1pg/ml 4 流式细胞术 —— 测内毒素的量而不是活性 5 化学发光测定法 6

17 内毒素检测的参考值 10pg/ml 以下 ： 健康人值 10-20pg/ml ： 病变观察期 大于 20pg/ml ： 内毒素血症 肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700

18 (1-3)-  -D- 葡聚糖

19 侵袭性真菌感染的定义 定义 : 指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和 内脏器官等所引起的真 菌感染性疾病，危害性 较大。 指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉和 内脏器官等所引起的真 菌感染性疾病，危害性 较大。 条件致病性真菌念珠菌属曲霉属其他

20 侵袭性真菌感染的特点 1. 不产生内毒 素和外毒素 素和外毒素 致病机理不明 致病机理不明 4. 早期症状无特异性， 往往被原发病掩盖，病 程长，发现较晚，死亡 率高 2. 致病力一般 较弱，机体免 较弱，机体免 疫低下时发生 疫低下时发生 3. 感染菌种变化， 白色念珠菌感染下 降，曲霉菌感染增 长趋势上升明显

21 1. 内源性诱因 2. 外源性诱因 影响机体抵抗力的各种疾病，如白血病、癌症、结核、 肺脓肿、糖尿病、肝脏疾病以及维生素缺乏等 广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂； 广谱抗生素，抗肿瘤药物和免疫抑制剂； 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植； 插管等侵袭性治疗，骨髓和实体器官移植； 免疫缺陷综合症 免疫缺陷综合症 侵袭性真菌感染的诱因

22 侵袭性真菌感染（ IFI ）现状 IFI 感染病死率很高 1 2 3

23 国内侵袭性真菌感染不容忽视 刘正印等，中华医学杂志 2003,83(5):399-402 感染人数

24 国内侵袭性真菌感染不容忽视 临床药物治疗杂志 2007 年第 5 卷第 1 期 感染率 (%)

25 中国感染与化疗杂志 2008 年 7 月 20 日第 8 卷第 4 期

26 尸检研究发现， 75% 的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊 诊断困难的主要原因 ： --- 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖 --- 确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者 的病情所限难以实施 --- 真菌检测项目开展相对不足或滞后 IFI 诊断困难及漏诊情况严重

27 主要可引发侵袭性真菌感染的疾病 肺炎 肺纤维 症 脑出血 脑梗塞 硬膜下血 瘤术后 胸部大动 脉瘤术后 糖尿病 再生障碍 性贫血 MODS DIC 胃癌，肝 癌，肝内 胆管癌， 肺癌，多 发性骨髓 瘤，白血 病，恶性 淋巴瘤 肺结核 腹腔内脓 肿 AIDS 呼吸系统疾病 感染症及寄生虫病循环系统疾病内分泌疾病 血液及造血器官疾病 肿瘤类

28 侵袭性真菌感染 ( invasive fungal infection, IF I) 的发病 率逐年上升, 其中又以侵袭性肺部真菌感染 ( invasive pulmonary fungal infection, IPF I) 最常见, 大约占 50% ～ 60% 。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可 高达 30% ～ 80% 。 侵袭性肺部真菌感染

29 临床表现 ：缺乏特异性, 多表现为发热、咳嗽、 咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。 现 状 ：两高两低一快 检测方法相对滞后, 早期诊断和治疗仍存在困难, 副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵, 导致病死率高。 高院内感染率和病死率 低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快 侵袭性肺部真菌感染

30 死亡率 (%) 诊断延迟 时间 (h) ICU 诊断延迟时间与死亡率的关系 11 33 30 35 10 15 20 25 30 35 12 h 12-24 h 24-48 h 24-48 h 48 h Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.

31 美国四大医疗中心做的一项回顾性研究 死亡率 (%) 诊断延迟时间 (d) Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31.

32 β1,3 真菌细胞膜、壁结构 羊毛固醇 C － 14 去甲基化酶 14 位还原和 7 － 8 位异构酶 角鲨烯环氧化酶

33 1-3-β-D- 葡聚糖本质及特点 真菌细胞壁成分，占 50% 以上 1 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分 2 用于侵袭性真菌感染的早期诊断 3

34 (1-3)-β-D- 葡聚糖特性 1.2.3. 对热极为稳定，高压 121 ℃并不能使其灭活。 在念珠菌和曲霉菌细胞 壁中含量较多，对 G 试验灵敏 试验灵敏。 当真菌进入人体血 液或深部组织后， 经吞噬细胞的吞噬 、消化等处理后， (1-3)-β-D- 葡聚糖可 从胞壁中释放出来 ，从而使血液及其 它体液中含量增高 。当真菌在体内含 量减少时，机体免 疫系统可将其清除 。 在浅部真菌感染 中， (1-3)-β-D- 葡聚糖未被释放 出来，故其在体 液中的量不增高。

35 “G” 试验缘何而来？  1-3-β-D- 葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物 中的 G 因子，引起裂解物凝固，故称 G 试验。 （ 1-3 ）  -D-Glucan LAL-RM( 反应物 ) LAL-RM( 反应物 ) G 因子 活化 G 因子 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 试验反应机理图：

36 内毒素与 β- 葡聚糖的检测比较 已知能与鲎试剂发生反应的物质有 细菌内毒素和 β- 葡聚糖，但它们的 反应曲线不一样。内毒素反应曲线 为 S 型特征曲线，而 β- 葡聚糖反应 曲线为经过 0 点的斜线。

37 内毒素和 β- 葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线

38 观察期不确定，费时费力，特 征性不明显并对医师的专业水 平要求高 辅助方法：临床表现，免疫学，病 理学，影像学检查等 用于实验室检测，已成为这一 领域研究的热点 3.PCR 技术：真菌的抗原、抗体及 代谢产物的血清学检查和真菌核酸 检测 对儿童及接受造血干细胞移植 患者、 ICU 患者不适用 2.GM 试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗 原检测。判断是否曲霉属真菌感染 耗时短，灵敏度高，特异性强， 定量检测可判断感染严重程度 1.G 试验：通过检测 (1-3)-β-D- 葡聚 糖的含量，判断是否有真菌感染 非传 统 检查 敏感性低，耗时长, 培养阳性率 低。培养结果是定性的，有些 标本采集困难 直接培养真菌法 传 统检 查传 统检 查 特 点 方 法 侵袭性真菌感染的临床检测方法对比

39  － D －葡聚糖的评价 可检测多种致病真菌感染 可检测多种致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌， 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，镰刀菌，地霉，组织胞浆菌， 毛孢子菌等 毛孢子菌等 不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等） 不能检测隐球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉等） 敏感性、特异性： 90 ％左右 对于念珠菌血症, G 试验检测是首选检查 对于念珠菌血症, G 试验检测是首选检查 J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.

40 BG 值在 IFI 临床表现出现之前就已经高于正常值  Pazos 等报道 5 例确诊 IFI 及 3 例临床诊断的 IFI 患者，发现 BG 值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部 HRCT 检 查发现以前 。 平均早于发热 5 d 早于呼吸道症状平均 10.7 d J Clin Microbiol ， 2005 ， 43(1) ： 299—305 G 试验检测评价

41  Odabasi 等对确诊为粒细胞缺乏人群进行为 期 3 周每周 2 次采血检测及临床观察 发现： BG 值开始高于 60 pg ／ ml 的时间比最后 确诊为 IFI 或临床诊断 IFI 平均提前了 10 d Clin Infect Dis ， 2004 ， 39(2) ： 199—205 G 试验检测评价

42  － D －葡聚糖参考值  健康人： < 10 pg/ml  可疑感染： 10 ~ 20 pg/ml  深部真菌感染： > 20 pg/ml

43 关于 G 试验建议 G 试验临床应用 1 明确诊断 （抗真菌药物治疗前） 2 治疗效果监测 （抗真菌药物治疗后） 3 连续 2 次采血进行 G 试验

44 临床细菌内毒素及 (1-3)-  -D-Glucan 检测的国内外发展  国外：血液（包括血浆、脑脊液、血清、腹水液、尿液、 唾液、乳汁等）中内毒素以及 (1-3)-  -D-Glucan 微量定量 检测已经成为现实，目前在美国、日本等国均已出现专用 细菌内毒素及 (1-3)-  -D-Glucan 检测仪器及配套的检测试 剂盒，而且获得 FDA 及厚生省批准文号，作为一种日常检 测项目。  国内： MB-80 检测系统，为国内独家研制和生产的检测 临床内毒素及 (1-3)-  -D-Glucan 的专用仪器，同时具有配 套的检测试剂盒 EKT-5Mset and GKT-%M set 获得 SDA 批准文号,

45 降钙素原

46 生化结构和生物合成 1 生物来源 2 降钙素原概述 116 个氨基酸组成，相对分子量为 13 KD 的糖蛋 白。在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网合成。 人血清 PCT 含量极低，约 0 ． 0025 μg/L 。当发生严重细菌感染和败 血症时，其浓度可增高 10000 倍。在甲状腺切除后严重感染患者血中 PCT 的浓度仍升高，推测各种器官中的巨噬细胞和单核细胞可能是败 血症时 PCT 的来源。

47 PCT 的半衰期大约为 20 ～ 24 h 。 PCT 的清除 途径尚不完全清楚。它很少经肾脏排出。因此血 浆 PCT 检测也适用于肾衰或人工肾治疗的患者。 代谢 3 降钙素原概述

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49 PCT 的临床应用特点 高敏感性和特异性 1 出现时间早 2 半衰期短 3 不受机体免疫状态的影响 4

50 PCT 的临床应用特点 可鉴别诊断全身与局部细菌性感染 5 可诊断良恶性肿瘤是否有继发感染 6 鉴别诊断新生儿败血症及败血症休克 7 可判断是呼吸道感染是否使用抗生素 8

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52 PCT 的检测方法 凝胶层析法和高效液相色谱法 1 酶免法和放免法 2 金标法 3 免疫荧光法 4

53 总 结 PCT 是一项快捷、有效的常规实验 指标，可帮助临床诊断、疗效观察与 指导用药。

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