琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 实 验 7实 验 7实 验 7实 验 7.  了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用 实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的.

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1 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 实 验 7实 验 7实 验 7实 验 7

2  了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用 实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的

3 竞争性抑制作用 抑制剂和底物的结构相似， 能和酶的底物分子竞争 与酶的活性中心相结合， 从而阻碍酶与底物结合 形成中间产物。 酶活性位点

4 抑制程度取决于抑制剂和底物对酶的相对亲和力 以及抑制剂和底物浓度比。 加大底物浓度可减弱甚至解除抑制作用。

5 实 验 原 理实 验 原 理实 验 原 理实 验 原 理 延胡索酸 琥珀酸 还原型甲烯蓝 ( 白 ) 琥珀酸脱氢酶 甲烯蓝 ( 蓝 ) E + S ES E + P 琥珀酸 丙二酸 E + I EI 琥珀酸脱氢酶

6 操 作 步 骤操 作 步 骤操 作 步 骤操 作 步 骤 1 、酶提取液的制备 1~1.3 g 兔肌肉 ( 剪碎 ) ＋海砂少许 (1/3 匙 ) +2ml 磷酸盐缓冲液 (1/15 mol/L) ，研磨成糊状， 然后再加 10ml 磷酸盐缓冲液 (1/15 mol/L) 混匀。 2 、纱布过滤（双层） 3 、取小试管五只，按书上 P40 表格加入各试剂。 最后加石蜡隔绝空气， 37 ℃水浴保温。 每间隔 5~10min 观察一次结果，并记录。

7 实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果 编号 12345 酶有有有有无 底物 +++ + 抑制剂 -++++ - 结果

8 注 意 事 项注 意 事 项注 意 事 项注 意 事 项 o 注意区分肌肉与筋膜； o 家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多； o 12 ml 缓冲液要分次加入，不可一次性加入； o 碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干； o 滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度； o 滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可； o 观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝； o 实验完成后试管要用皂粉清洗。

9 改良 Mohum 法测定 谷 - 丙转氨酶 (GPT) 活性 实 验 22

10 实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的 掌握 GPT 活性测定的基本原理 熟悉 GPT 活性测定的具体操作方法 了解血清 GPT 活性测定的临床意义

11 二、实验原理： 丙氨酸 +α- 酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸 在 520nm 波长测定其光密度，与经同样处理标准的丙酮酸 溶液比较，即可计算谷 - 丙转氨酶的活性。 GPT 2 、 4- 二硝基苯肼 NaOH 丙酮酸二硝基苯腙 （棕色） 丙酮酸二硝基苯肼

12 血清谷 - 丙转氨酶活性单位 在 pH 7.4 、 37 ℃条件下， 每毫升肝匀浆与底物保温 30min 后， 每生成 2.5  g 的丙酮酸作为 1 个谷 - 丙转氨酶的活性单位， 血清中 GPT 正常值为 2-40 U/mL 。

13 实 验 步 骤实 验 步 骤实 验 步 骤实 验 步 骤 标准管法测定酶活性： 1 、取干燥试管 5 支，标号 测定管 1 测定管 2 对照管 标准管 空白管 2 、依次加入试剂，混匀， 37 ℃保温 3 、呈色反应后， 520nm 比色测 OD 值

14 谷丙转氨酶活性单位 /mL 鼠肝匀浆 = ? U/ml 方法一：以空白管调 0 ，测 OD 测定 、 OD 标准 、 OD 对照 实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果 30min 生成丙酮酸的质量 1 活性单位 = ———————————— · —— 2.5  g V 测定 方法二：以空白管调 0 ，测 OD' 标准 以对照管调 0 ，测 OD' 测定

15 注 意 事 项注 意 事 项注 意 事 项注 意 事 项 1 保温温度和时间要精确，即酶发挥催化作用的 环境要一致。 2 掌握酶活性单位的概念和计算方法 3 微量移液器的使用

16 ALT 测定的临床意义 用本法测定血 ALT 正常值为 40 U/ml 以下 肝细胞中 ALT 最丰富，当肝脏疾病致肝细胞受损时， ALT 即大量释放入血液，致使血清中 ALT 活性增高。 测定 ALT 是检查肝功能的重要指标之一。 显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死； 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎； 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。 饮酒、油腻饮食、过劳等因素也会导致 ALT 短暂增高

17 谷丙转氨酶活性单位 /mL 鼠肝匀浆 = ? U/ml 方法一：以空白管调 0 ，测 OD 测定 、 OD 标准 、 OD 对照 实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果实 验 结 果 OD 测定 测定管中生成丙酮酸的质量 = ———— × m 标准 OD 标准 OD 对照 测定管中生成丙酮酸的质量 = ———— × m 标准 OD 标准 30min 中生成丙酮酸的质量 = m 测定 – m 对照 OD 测定 -OD 对照 = ——————— × m 标准 OD 标准 30min 生成丙酮酸的质量 1 活性单位 = ———————————— · —— 2.5  g V 测定

18 方法二：以空白管调 0 ，测 OD' 标准 以对照管调 0 ，测 OD' 测定 OD' 测定 ————× m 标准 1 OD' 标准 活性单位 = ———————— · —— (U/ml) 2.5  g V 测定