实验二 培养基的制备 消毒与灭菌. 培养基配制实验原理  培养基是人工配制的适合微生物生长繁 殖或积累代谢产物的营养基质。  人工制备培养基的目的，在于给微生物 创造一个良好的营养条件。

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1 实验二 培养基的制备 消毒与灭菌

2 培养基配制实验原理  培养基是人工配制的适合微生物生长繁 殖或积累代谢产物的营养基质。  人工制备培养基的目的，在于给微生物 创造一个良好的营养条件。

3 培养基配制要素  营养：碳源、氮源、能源、生长因子、 水分和无机盐；  适宜的酸碱度 (pH 值 ) 和一定缓冲能力；  一定的氧化还原电位；

4 培养基的分类 根据微生物的种类和实验目的的不同， 培养基分类可以按以下方式： 1. 按成分的不同分 2. 按培养基的物理状态分 3. 按培养基的用途分

5 按照培养基的成分来分  天然培养基 : 主要成分是复杂的天然有机物 质：如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养 基、 LB 等。  合成培养基 : 用化学成分完全了解的纯化合 物药品配制而成的培养基：高氏一号培养 基和査氏培养基等。

6 按照培养基的物理状态  固体培养基：加入凝固剂，如 1.5% ~ 2.0% 琼脂  半固体培养基：加入少量凝固剂，如 0.2% ~ 0.7% 琼脂  液体培养基：不含任何凝固剂

7 按照培养基的用途分  基础培养基：如牛肉膏蛋白胨培养基。  营养培养基（加富培养基）：如添加血清、血液 等。  鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生 物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢 产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显 的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种 微生物与他种微生物区别开来。如酪素培养基、 伊红美蓝培养基等  选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感 性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要 的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长， 从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如无氮 培养基、马丁氏培养基等。

8 加富培养基是用来增加所要分离的微 生物的数量，使其形成生长优势，从 而分离到该种微生物； 选择培养基则一般是抑制不需要的微 生物的生长，使所需要的微生物增值， 从而达到分离所需微生物的目的。 加富培养基与选择培养基的区别

9 牛肉膏蛋白胨培养基的制备 应用最广泛的细菌基础培养基，普通培养基  牛肉膏： 3 g  蛋白胨： 10 g  NaCl ： 5 g  琼脂： 15-20 g  水： 1000 mL  pH ： 7.4~7.6

10 马铃薯培养基（ PDA ）的制备 用来培养真菌  马铃薯： 200 g  蔗糖（葡萄糖） 20 g  琼脂： 15-20 g  水： 1000 mL  pH ： 自然 马铃薯去皮，切成块煮沸 30 分钟，然后用纱布过滤； 滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至 1000 mL 。

11 高氏 Ⅰ 号培养基的制备 用来培养放线菌  可溶性淀粉： 20 g  KNO 3 ： 1 g  NaCl ： 0.5 g  K 2 HPO 4 ·3H 2 O ： 0.5 g  MgSO 4 ·7H 2 O ： 0.5 g  FeSO 4 ·7H 2 O ： 0.01 g  琼脂： 20 g  水： 1000 mL  pH ： 7.2~7.4

12 无氮培养基的制备 用来培养固氮菌  葡萄糖： 10 g  KH 2 PO 4 ： 0.2 g  MgSO 4 ·7H 2 O ： 0.2 g  NaCl ： 0.2 g  CaSO 4 ·2H 2 O ： 0.2 g  CaCO 3 ： 5 g  琼脂： 20 g  水： 1000 mL  pH ： 7.0~7.2

13 豆芽汁培养基的制备 用来培养酵母菌  黄豆芽： 10 0 g  蔗糖（葡萄糖）： 50 g  琼脂： 20 g  水： 1000 mL  pH ： 自然 称取新鲜黄豆芽 100 g ，放入烧杯中加水煮沸约 30 min ， 用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至 1000 mL ，最后灭菌。

14 麦氏（ Meclary ）培养基的制备 用来培养酵母菌，利于酿酒酵母子囊孢子的形成  葡萄糖： 1 g  KCl ： 1.8 g  酵母浸膏： 2. 5 g  醋酸钠： 8.2 g  琼脂： 20 g  水： 1000 mL  pH ： 自然

15 操作步骤 1. 称量 称量 2. 溶化 溶化 3. 补足水分，调 pH 补足水分，调 pH 4. （过滤） 5. 分装 分装 6. 加塞 7. 包扎 包扎 8. 灭菌 灭菌 9. 搁置斜面 搁置斜面 10. 无菌检查 无菌检查

16  称量药品时，严防药品混杂。称完一种 药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称 取另一药品。瓶盖也不要盖错。  药品不要弄错。如： K 2 HPO 4 和 KH 2 PO 4 、 水合形式和无水形式的化合物要注意分 辨。

17  培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。 因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的 顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种 或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。  对于微量成分，可先配制成高浓度的储备液， 按比例换算后再加入。  琼脂溶化过程中，要控制火力并不断搅拌，以 免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。  不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养 基。

18  调 pH 值以前，先补足水分。  pH 值不要调过头，以免回调影响个离 子浓度。

19  固体分装：不超过试 管高度的 1/5 ；不超 过三角烧瓶容积的一 半为宜。  分装过程中，注意不 要使培养基沾在管 （瓶）口上以免污染 棉塞而引起污染。

20  配好培养基后要贴上标签，写清培养基 类型、组别、配制时间。

21 培养基灭菌 在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何 杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所 都要进行严格的消毒和灭菌。  配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生 物  微生物生长繁殖：  消耗养分  改变培养的酸碱度  产生毒素或者抑制物

22 消毒与灭菌  消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法 消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体 的过程。  灭菌则是指采用物理、化学和生物的方法杀 灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。

23 消毒与灭菌方法  加热灭菌  干热灭菌 干热灭菌  湿热灭菌 湿热灭菌  过滤除菌 过滤除菌  辐射灭菌  放射线辐照灭菌  紫外线灭菌 紫外线灭菌

24 干热灭菌  干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质 凝固变性而达到灭菌的目的.  干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。

25  细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌 体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋 白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。  因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要 高（ 160 ～ 170 ℃），时间要长（ 1 ～ 2h ），但 干热灭菌温度不能超过 180 ℃，否则，包器皿 的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

26 高压蒸气灭菌  高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅 内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。 待水蒸气急剧将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气 阀，继续加热。由于水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内 的压力，从而使沸点增高，得到高于 100 ℃的温度。导 致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。  一般培养基在 0.1 MPa 下， 121 ℃维持 15 ～ 30 min 可达到 彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品 的性质和容量等具体情况而有所改变。

27 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。 其原因有三： 一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固， 因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低； 二是湿热的穿透力比干热大； 三是湿热的蒸气有潜热存在。 1 g 水在 100 ℃时，由气态变为液态时可放出 2.26 kJ( 千焦 ) 的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌 物体的温度，从而增加灭菌效力。

28 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空 气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀 压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含 有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度 低于饱和蒸气的温度。 当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼 洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细 擦干锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀 和变质。 要检查压力表上的指数为 “ 0 Mpa ” 后才能打开 锅盖。 外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否 则会引起装置故障、起火、短路。

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30 过滤除菌 过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体 中细菌的方法。根据不同的需要选用不同 的滤器和滤板材料。 此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中 各种物质的化学成分，但由于滤量有限， 所以一般只适用于实验室中小量溶液的过 滤除菌。

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32 紫外线灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为 200~300 nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260nm 的杀菌力 最强。 在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和 时间的乘积成正比。 紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚 体的形成和 DNA 链的交联，从而抑制了 DNA 的复 制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成 [O] ，再使 O 2 氧化生成臭氧（ O 3 ）或使水（ H 2 O ） 氧化生成过氧化氢（ H 2 O 2 ）。 O 3 和 H 2 O 2 均有杀菌 作用。

33 紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室， 接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。 紫外线灯距照射物以不超过 1.2m 为宜。 为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前， 可在无菌室内 ( 或接种箱内 ) 喷洒 3% ～ 5% 石炭 酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃 降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。 无菌室内的桌面、凳子可用 2% ～ 3% 的来苏尔 擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效 果，达到灭菌目的。

34  灭菌的试管培养基冷至 50 ℃ 左右再搁置， 以防斜面上冷凝水太多。  斜面长度不超过试管总长的一半。

35  将灭菌的培养基放入 37 ℃的温室中培 养 24 － 48 小时，以检查灭菌是否彻底。

36 实验任务  每组配制 1400 mLPDA 培养基（ P242 ）  趁热将培养基分装至 12 把试管（ 12×7 支，不超 过管高 1/5 ）；剩余的培养基装入锥形瓶中（每 瓶约 100 mL ）  对试管、锥形瓶进行包装，贴上标签（培养基 名称、配制时间、组别）  高压蒸汽灭菌  取出，搁置斜面，无菌检查

37 作业  实验报告  思考题 1 ：培养基配置好后，为什么必须立即 灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌 的？  思考题 2 ：如果需要配制一种含有某抗生素的 固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或 工作浓度）为 50ug/mL ，你将如何操作？（提 示：抗生素在高温下易失效）  下一次实验：细菌的简单染色