食品中亞硝酸鹽殘留量測定 國立高雄海洋科技大學 水產食品科學系.

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1 食品中亞硝酸鹽殘留量測定 國立高雄海洋科技大學 水產食品科學系

2 食品添加劑 保色劑(Color fasting agent，發色劑，助色劑)
食品衛生管理法第三條對〝食品添加物〞所下之定義是「本法所稱食品添加物，係指食品之製造、加工、調配、包裝、 運送、貯藏等過程中用以著色、調味、防腐、漂白、乳化、增加香味、安定品質、促進發酵、增加稠度、增加營養、防止氧化或其他用途而添加或接觸於食品之物質」 在食品的加工過程中，為了改善或保護食品的色澤，除了使用色素直接對食品進行著色外，有時還需要添加適量的保色劑，使製品呈現良好的色澤 。    亞硝酸鹽之測定

3 食品添加物使用範圍及用量標準-第5類：保色劑
※以下資料僅供參考，請仍需依衛生署相關最新法令 食品添加物使用範圍及用量標準 第1類： 防腐劑 第2類： 殺菌劑 第3類： 抗氧化劑 第4類：漂白劑 第5類：保色劑 第6類：膨脹劑 第7類：品質改良用、釀造用及食品製造用劑 第8類：營養添加劑 第9類：著色劑 第10類：香料 第11類：調味劑 第12類： 粘稠劑（糊料） 第13類：結著劑 第14類：食品工業用化學藥品 第15類：溶劑 第16類：乳化劑 第17類：其他 亞硝酸鹽之測定

4 原理 在食品加工過程中，常會添加保色劑(color fasting agent)，使食品呈現出較好的顏色，以增加消費者之接受度。在肉類製品中常使用的保色劑有硝酸鹽(nitrate)、亞硝酸鹽(nitrite)等，依據食品衛生法規規定，硝酸鹽類與亞硝酸鹽類不得使用於生鮮肉類，可使用於肉製品和魚製品，其二氧化氮(NO2)殘留量必須在0.07 g/kg以下。

5 亞硝酸鹽之功用-1 保色作用(固定肉色) 保色劑以硝酸鹽及亞硝酸鹽為代表，二者皆能使肉製品呈現鮮紅色澤，
硝酸鹽用於肉類製品作發色劑，肉製品由於使用亞硝酸鹽而呈鮮紅色為使肉製品呈鮮艷的紅色，在加工過程中多添加硝酸鹽（鈉或鉀）或亞硝酸鹽。 硝酸鹽在細菌硝酸鹽還原酶的作用下，還原成亞硝酸鹽。 亞硝酸鹽在酸性條件下會生成亞硝酸。 在常溫下，也可分解產生亞硝基（NO），此時生成的亞硝基會很快的與肌紅蛋白(Myoglobin)反應生成穩定的、鮮艷的、亮紅色的氧化氮肌紅色素(nitrite oxide myoglobin) 氧化氮肌紅色素而為經55~60℃加熱後形成氧化氮血色質(nitrosyl hemochrome)之美麗紅色澤。故使肉可保持穩定的鮮艷。 亞硝酸鹽之測定

6 亞硝酸鹽之功用-1 固定肉色 亞硝基肌紅蛋白加熱會變成亞硝基肌血色素原，而產生典型醃漬肉的淡粉紅色。 亞硝基肌紅蛋白
一般約20~30ppm之亞硝酸鹽即足夠固定肉色 亞硝酸鹽之測定

7 肉之色調變化 紅紫色 鮮 紅色 亞硝酸鹽(NO2) 褐色 深 紅色 淡 褐色 粉 紅色 淡 色 Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+
氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin) O2 Fe2+ 肌紅蛋白(myoglobin) Fe2+ Fe3+ Fe3+ 亞硝酸鹽(NO2) 褐色 Fe2+ Fe3+ 深 紅色 Fe2+ Fe3+ 變性肌紅蛋白(metmyoglobin) 加熱 Fe2+ Fe3+ 淡 褐色 Fe2+ Fe3+ 氧化氮肌紅色素(nitrite oxide myoglobin) 加熱 粉 紅色 加熱後變性肌紅蛋白(metmyoglobin) Fe2+ Fe3+ Fe2+ Fe3+ 淡 色 亞硝酸鹽之測定 氧化氮血色質(nitrosyl hemochrome) Oxided pophyrins

8 亞硝酸鹽之功用-2 抑制微生物亞硝酸鹽也是一種防腐劑，它可抑制微生物的生長或繁殖，亞硝酸鹽在pH 5.7~6.0下，可抑制Aerobactor, Achromobactor, Escherichia, Micrococcus及 Pseudomonas等生長，在無氧狀態下，可抑制厭氧性細菌的萌芽。抑制肉毒桿菌需100 ppm以上之亞硝酸鹽才有效果，若同時加熱，僅需3.5 ppm即可抑制。亞硝酸鹽可以阻止C. botulinum發芽上的作用，防止肉毒桿菌的生長及毒素的分泌。 (1)肉毒桿菌：肉中的主要中毒菌為Clostridium botulinum，其引起的中毒發生率雖然不高，但是卻具有極高的致命性。肉毒桿菌屬厭氧、格蘭陽性(Gram positive)、產芽胞細菌。肉毒毒素屬於神經毒素(neurotoxin)的一種，以往中毒事件多發生於香腸、火腿和罐頭食品中。 (2)神經毒素中毒症狀：噁心、嘔吐、腹痛等消化器官症狀、視力減退、吞嚥困難、四肢麻痺、橫隔膜或呼吸系統會發生麻痺而致死。 亞硝酸鹽之測定

9 亞硝酸鹽之功用-3 增加風味( 臘味, cured flavor )
將亞硝酸鹽和硝酸鹽加入肉中醃漬，產生特殊的醃肉風味(臘味)，促進消費者之購買慾。 亞硝酸鹽之測定

10 亞硝酸鹽之功用-4 抗氧化作用(延緩酸敗之發生) 安全衛生指標：
醃漬(curing)-將肉品加入食鹽，硝酸鹽，經一段時間所處理的方式。能延長肉中不飽和脂酸的氧化，可延緩酸敗之發生。因其轉變之一氧化氮NO會與肉中肌紅蛋白Mb結合，而使加熱後肉中肌紅蛋白Mb之鐵Fe不會游離以抑制脂肪的酸敗。 安全衛生指標： 亞硝酸鹽使用過量，會發生綠變，這在發酵香腸最常見。 亞硝酸鹽之測定

11 保色劑的應用限制-1 亞硝酸鹽是添加劑中急性毒性較強的物質之一，是一種劇毒藥，可使正常的血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，失去攜帶氧的能力，導致組織缺氧。  亞硝酸鹽之測定

12 亞硝酸的添加量 亞硝酸的添加量 亞硝酸的添加量 Frankfurter type sausage 60-80ppm Sausage made precooked ingredients 70-80ppm Cooked Cured products 80-120ppm Dry sausage ppm Raw ham 50-150ppm 保色劑的應用限制-2 亞硝酸鹽的致癌性 亞硝酸鹽為亞硝基化合物的前體物，其致癌性引起了國際性的注意，因此各方面要求把硝酸鹽和亞硝酸鹽的添加量，在保證變色的情況下，限制在最低水平。 抗壞血酸與亞硝酸鹽有高度親和力，在體內能防止亞硝化作用，從而幾乎能完全一直亞硝基化合物的生成。所以在肉類醃製時添加適量的抗壞血酸，有可能防止生成致癌物質。 亞硝酸鹽之測定

13 致癌物-亞硝酸胺 H+ + H2O 2(NO2-) 2(HNO2-) N2O3 亞硝酸根 亞硝酸 亞硝酸酐 R2NH 二級胺 R2NN
nitrosamine 致癌物 HNO2 亞硝酸 亞硝酸鹽之測定

14 第（五）類 保色劑 ※最近異動資訊 訂定「保色劑類食品添加物亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、硝酸鈉及硝酸鉀等之使用範圍及限量」。 (衛生署食品衛生處 2004/8/9 發文字號：衛署食字第０九三０四一０一六一號) 公告日期 編號 品名 使用食品範圍及用量標準 使用限制 001 亞硝酸鉀 Potassium Nitrite 1.本品可使用於肉製品及魚肉製品；用量以NO2殘留量計為0.07 g/kg以下。 2.本品可使用於鮭魚卵製品及鱈魚卵製品；用量以NO2殘留量計為 g/kg以下。 生鮮肉類、生鮮魚肉類不得使用。 亞硝酸鹽之測定

15 第（五）類 保色劑 93. 8. 5 002 亞硝酸鈉 Sodium Nitrite
1.本品可使用於肉製品及魚肉製品；用量以NO2殘留量計為0.07 g/kg以下。 2.本品可使用於鮭魚卵製品及鱈魚卵製品；用量以NO2殘留量計為 g/kg以下。 生鮮肉類、生鮮魚肉類不得使用。 003 硝酸鉀 Potassium Nitrate 亞硝酸鹽之測定

16 第（五）類 保色劑 93. 8. 5 004 硝酸鈉 Sodium Nitrate
1.本品可使用於肉製品及魚肉製品；用量以NO2殘留量計為0.07 g/kg以下。 2.本品可使用於鮭魚卵製品及鱈魚卵製品；用量以NO2殘留量計為 g/kg以下。 生鮮肉類、生鮮魚肉類不得使用。 亞硝酸鹽之測定

17 硝酸鹽和亞硝酸鹽至今仍使用之因？ 雖然硝酸鹽和亞硝酸鹽的使用受到了很大限制。 但因其對身體有害，故對其使用於食品之使用量和殘留量有嚴格要求。
但其使用原因是亞硝酸鹽對保持醃製肉製品的色、香、味有特殊作用，迄今未發現理想的替代物質。 更重要的原因是亞硝酸鹽對肉毒梭狀芽孢桿菌的抑製作用。 但因其對身體有害，故對其使用於食品之使用量和殘留量有嚴格要求。 亞硝酸鹽之測定

18 1.添加抗壞血酸 促進亞硝酸鹽抑制肉毒桿菌生長，並還原亞硝酸為一氧化氮(NO, nitric oxide)。
減少亞硝酸鹽殘留量的方法 1.添加抗壞血酸 促進亞硝酸鹽抑制肉毒桿菌生長，並還原亞硝酸為一氧化氮(NO, nitric oxide)。 Fig. ROLE OF NITRITE, ASCORBATE AND HEAT IN CURED MEAT PIGMENT FORMATION 亞硝酸鹽之測定

19 減少亞硝酸鹽殘留量的方法 2.添加酸性焦磷酸鈉 促進亞硝酸鹽與肌紅蛋白的作用。 3.添加己二烯酸 有抑制肉毒桿菌的效果。
4. 減小肉製品中的脂肪顆粒 肉製品殘留的亞硝酸鹽，在脂肪部分多於瘦肉部分，此外，在脂肪部分更易形成亞硝胺。 亞硝酸鹽之測定

20 減少亞硝酸鹽殘留量的方法 5. 提高醃漬液溫度 有助於醃漬液吸附於肉中及提高亞硝酸鹽與肌紅蛋白的反應速率。
6. 採用真空細切、攪拌、滾打、按摩處理 低氧下進行可提高肌肉中粒線體還原酵素的活性，有助於亞硝酸鹽還原為一氧化氮。 7. 採用低溫燻煙處理 產生的酚基化合物可促進硝化作用且低溫下可以使肉中還原酵素有更充裕的作用時間，將亞硝酸鹽還原為一氧化氮。 亞硝酸鹽之測定

21 測定方法的選用 硝酸鹽可與2,4-間二甲苯酚或二磺酸酚作用形成黃色化合物，硝酸根可硝化苯形成硝基苯等等 亞硝酸根可重氮化後偶聯顯色
而亞硝酸根和硝酸根又可經氧化、還原互相轉化 利用這些性質即可進行比色法或氣相色層析法等硝酸鹽或亞硝酸鹽測定。 目前普遍用於食品中微量測定的是比色法，因為比色法設備簡單易於操作，靈敏度可逹到要求 亞硝酸鹽係採用CNS10888食品中保色劑之檢驗法 （亞硝酸鹽之檢驗） 亞硝酸鹽之測定

22 本實驗乃將樣品去除脂質及蛋白質後，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對胺基苯磺酸氮化，再與鹽酸乙二胺(N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride)偶合成紫紅色物質，在540 nm可測其吸光值。其反應如下：

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24 材料與儀器 香腸、火腿。 沈澱劑I：取亞鐵氰化鉀(potassium ferrocyanride；K4Fe(CN)6．3H2O) 10.6 g溶於水，定量至100 mL。 沈澱劑II：取醋酸鋅(zinc acetate) 220 g及冰醋酸30 mL溶於水，定量至1,000 mL。

25 飽和四硼酸鈉(sodium tetraborate)溶液：取四硼酸鈉5 g溶於100 mL溫水中，冷卻至室溫備用。
呈色液I：取磺胺(sulfanilamide) 2 g加800 mL於水浴上加熱溶解後，冷卻過濾，濾液緩緩加入濃鹽酸(HCl) 100 mL，再加水定量至1,000 mL。 呈色液II：取乙二胺鹽0.25 g溶於水，再定量成250 mL，並儲存於褐色瓶，本液宜新鮮配置。

26 呈色液III：取濃HCl 445 mL，加水定量至1,000 mL。
亞硝酸鈉(sodium nitrite；NaNO2)標準溶液之調製：精稱150 m g NaNO2（放烘箱內，100℃烘30分鐘後，移至乾燥器內，冷卻至室溫）溶於水，定量至100 mL，取此溶液1 mL，加水定量至1,000 mL，此溶液濃度為每mL相當含有亞硝酸根離子(NO2-) 1 μg。

27 水浴鍋。 分光光度計。 三角錐瓶。 定量瓶。

28 方法及步驟 標準曲線之繪製 樣品液之調製 樣品液之測定

29 標準曲線之繪製 分別取蒸餾水（空白試驗）及NaNO2標準溶液（每毫升含NO2- 1 μg）5 mL、10 mL、20 mL、30 mL分置於100 mL定量瓶，各加水至60 mL，加入呈色液I 10 mL及呈色液III 6 mL混勻，靜置5分鐘，再加入呈色液II 2 mL混勻，靜置15分鐘，再加水定量至100 mL，以540 nm測其吸光值，並繪出標準曲線。

30 樣品測定和標準曲線之製作 1 mL之NO2-(1μg/mL) 0空白 (水) 5 10 20 30 10mL sample 2
60 55 50 40 3 加入 呈色液 I ( mL) 4 加入呈色液 III( mL) 6 混合均勻靜置 5分鐘 v 加 呈色液 II( mL) 7 混合均勻靜置 15分鐘 8 定容至( mL) 100 9 NO2-終量 (μg)(X軸) 或NaNO2(μg)(X軸) 7.5 15 45 吸光值540nm (Y軸) 亞硝酸鹽之測定

31 樣品液之調製 精稱碎火腿5 g (Ws)於三角錐瓶內，加入飽和四硼酸鈉溶液2.5 mL及80℃以上之蒸餾水50 mL，置於沸水浴上加熱15分鐘。 放冷至室溫，加入沈澱劑I及沈澱劑II各1 mL，以蒸餾水定量至100 mL混勻，靜置30分鐘，過濾後取濾液供作檢液。

32 樣品液之測定 取樣品液10 mL (V)及蒸餾水（空白試驗）分置於100 mL定量瓶內，加水至60 mL，再加入呈色液I 10 mL、呈色液III 6 mL混勻，靜置5分鐘，再加入呈色液II 2 mL混勻，靜置15分鐘，加水定量至100 mL，以波長540 nm測吸光值，由標準曲線求NO2-之含量(c μg)。

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34 結果

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38 吸光值 當一束光通過含吸收物種的溶液，光束強度由P0調減至P。
定義介質的穿透率（transmittance，簡記為T）與介質的吸光值（absorbance，簡記為A）如下： T=P／P0 A= log (P／P0)=-log T 在單一頻率的光源中，吸光值正比於溶液濃度c、光徑長度b與物質的吸收特性，其關係式可表示如下： A=εbc 其中ε為物質莫耳吸收係數(molar absorptivity)。 　　　　　 亞硝酸鹽之測定