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1 MPF的研究历程 及其 特性描述 耿伟平 韩娇娇

2 生物学专业词汇 Amphibian 两栖动物 Oocyte 卵母细胞 Germinal vesicle 生发小泡 Steroid 类固醇
Hormone 激素 Progesterone 孕酮 Donor 供体 Recipient 受体 MPF(maturation promoting factor）成熟促进因子

3 生物专业词汇 Fertilization 受精 Xenopus 爪蟾 Mammalian 哺乳动物 Sea urchin 海胆
HeLa 海拉细胞（人宫颈癌传代细胞） yeast 酵母 Vertebrate 脊椎动物

4 荣获2001年诺贝尔生理学或医学奖 发现了控制细胞周期的关键物
利兰·哈特韦尔 Leland H. Hartwell 美国 弗雷德·哈钦森癌症研究中心 美国西雅图 b 1939年 蒂莫西·亨特 R. Timothy (Tim) Hunt 英国 帝国癌症研究基金 英国伦敦 b 1943年 保罗·纳斯 Sir Paul M. Nurse  英国 帝国癌症研究基金 英国伦敦 b 1949年

5 CDK和细胞周期蛋白是控制和协调DNA合成、染色体分离和细胞分裂的重要分子。 CDK和细胞周期蛋白一起使细胞从一个细胞周期到下一个细胞周期。

6 模式生物

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8 Leland Hartwell —他鉴定了参与细胞周期控制的特定基因，称为CDC-基因(细胞分裂周期基因)。其中一个基因，CDC28，控制细胞周期的第一步，即通过G1期。 — Hartwell同时也确定了“控制点”在细胞周期控制中的基本作用。这些控制点监控着上一阶段中所有步骤是否正确地进行了，而且保证了细胞周期各阶段之间的正确顺序。

9 Paul Nurse CDK和细胞周期蛋白一起形成了一个酶，该酶可以通过化学修饰作用(磷酸化)激活其它蛋白。CDK分子的数量在细胞周期中保持恒定，但是其活性在细胞周期蛋白的调控作用下具有较大的变化。

10 Tim Hunt:发现了细胞周期蛋白，即与CDK分子相结合的蛋白。

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12 控制细胞周期的基本分子机制是在进化过程中是高度保守的，而且在酵母、昆虫、植物、动物和人类中以相同的方式发挥作用。

13 细胞周期调控的实际应用 The Implications of the Discoveries
癌细胞中染色体的不稳定性可能是源于受损的细胞周期控制。该图显示了正常细胞和癌细胞中相同的三对染色体(1号、3号和14号染色体)的差异。在癌细胞中，染色体数目可能会有改变(非整倍性)，部分染色体还有可能进行重组(以不同颜色显示)。

14 试验研究——山重水复与柳暗花明

15 试验研究——山重水复与柳暗花明 Paul Nurse和Tim Hunt是20多年的好朋友，他们有很多共同点，比如都是研究错综复杂的细胞分裂的分子舞蹈的先驱，都在Britain‘s Imperial Cancer Research Fund(ICRF)工作。Nurse是Director－general而Hunt则是细胞周期调控实验室的主任。据Nurse说，他们两个的性格是互补的。而今，这两个好朋友又多了一个共同点，他们一起分享了2001年的科学界最高荣誉--诺贝尔奖。

16 在20年代时，细胞周期仍是一个黑匣子，科学家们只是通过显微镜观察到一些宏观上的细胞运作，至于什么分子在调控这些过程，人们对此一无所知，一些科学家在拼命寻找一个入手点，Nurse回忆说："这就像大海捞针一样困难。"

17 60年代末，美国华盛顿FredHutchinson癌症研究中心的Hartwell，一个做酵母遗传学研究的专家，开始把一个project交给他实验室的一个本科生，华盛顿大学的Brian Reid，“我给了他一些酵母的突变株，它们在高温下会形成很奇特的形状，”Hartwell回忆说，“这些突变株在分裂上有缺陷，所以在一两代之后就会形成一个很大的芽。 “Hartwell马上意识到这是研究分裂的极好素材，到了70年代早期，他已经成功的从这些突变株中分离出一系列突变的基因，命名为cdc（cell cycle division）基因。

18 当Hartwell公布他的成果时，Nurse同学刚刚在East Anglia大学完成研究生课程，他的方向是研究氨基酸代谢的，但因为当时那个实验室的氨基酸分析仪老是不听话，他不得不花大量的时间来babysetting那个破机器，这就令他有足够的空闲时间去看大量的文献，包括Hartwell的发现。

19 Nurse回忆说："我发现这个遗传学方法相当好。"所以在他拿到phD学位后，就来到了英国Edinburgh大学工作，也开始在另一种酵母--裂殖酵母中来找细胞周期基因，跟Hartwell一样，也很快拿到一系列突变基因，也叫“wee”突变，它们作用在酵母进入有丝分裂的初期，其中wee2,也就是Nurse开始称为cdc2的基因，被他证明是控制细胞分裂起始的。Nurse后来又转到了Sussex大学，稍后又来到Oxford，期间他跟同事一起发现cdc2基因编码一种蛋白激酶，而且他们发现cdc2跟Hartwell在 裂殖酵母中发现的cdc28有相似之处。就此看来，Nurse的获奖有一定程度上要感谢那部破机器。

20 与此同时，在剑桥刚完成phD的Hunt，来到Massachusetts的Marine Biological Laboratory，他开始致力于研究海胆卵的受精过程是如何触发蛋白质合成的，这是海胆胚胎发育前期的重要步骤。但是这条路很快走进了个死胡同中，难以继续。1982，Hunt开始尝试一个他现在称为是"绝望中的疯狂"的实验方法。他要将受精卵的蛋白质合成谱跟单性生殖的作比较，结果是，用他的话说，"一个崭新的发现"。在受精卵中，分裂时有种浓度较高的蛋白的浓度会大幅度下降，然后又上升，直到下一次分裂周期又下降。Hunt把这种蛋白命名为cyclin，即周期蛋白。

21 实际上，Hunt和Nurse分别研究了一个问题的两个方面，进一步的工作表明，cyclin调节cdc2一类蛋白的激酶活性，这类蛋白后来被成为cdks，即cyclin依赖性的蛋白激酶。实际上，cdc2跟调节它的cyclin组成的复合物就是成熟促进因子MPF。MPF是70年代早期由日本科学家Yoshio Masui在青蛙卵中发现的，不过它的具体细节一直搞不清楚，直到此时，一切谜团才被解开。1998年, Yoshio Masui与Hartwell, Nurse一起荣获the Lasker Basic Medical Research Award，不过为什么诺贝尔奖没有他，

22 1987年，Nurse又在人中分离出cdc2同源的cdk1。这样，整个细胞周期的调节的分子机制的脉络就清晰了。

23 MPF 研究历程

24 Yoshio Masui(Toronto大学)和 Clement Market(yale大学
一、当两栖动物的卵母细胞临近卵子发生的末期时，大细胞核（生发小泡）向细胞外围移动 2 随后，核被膜分解。在靠近卵母细胞动物极的地方，凝聚的染色体沿中期板（赤道板）排列，经过第一次减数分裂，产生次级卵母细胞和一个极体。

25 3 通过用类固醇激素—黄体酮（孕酮），对完整的卵母细胞进行处理，能够发现与细胞成熟有关的过程，eg.生发泡破裂和经过第一次减数分裂 。
4 黄体酮处理卵母细胞13—18小时期间，生发泡在卵母细胞表面附近运动，这是能够观察到的第一个成熟标志。 5 不久，生发泡解体。孕酮处理36小时后，卵母细胞进入第二次减数分裂中期。

26 6 如果孕酮只是通过在卵母细胞外面表面、介导，从而诱导成熟，那么如果将激素注入卵母细胞内，卵母细胞将没有任何反应。
7 激素在细胞表面的活动诱发了卵母细胞质里的次级变化，导致生发泡破裂和与成熟相关的其他变化

27 二、1 为了解更多的细胞质对诱发成熟的反应变化，Yoshio Masui(Toronto大学)和 Clement Market(yale大学)开始了一系列实验。他们取走经孕酮处理的不同阶段的单独的蛙卵母细胞，将供体细胞质的40—60纳米注入完全生长的不成熟未经处理的卵母细胞中。 2 他们发现，从卵母细胞（孕酮处理后的第12小时的卵母细胞）取出的细胞质对受体有很微小甚至没有影响。 3 然而，这一时期之后，细胞质获得了这种在受体细胞内诱导成熟的能力。 4 从供体卵母细胞取出的细胞质在经孕酮处理20小时后表现出最大效力，到40小时效力开始下降

28 Figure1

29 5 然而，从早期胚胎中取出的细胞质能继续表现出诱导卵母细胞成熟的能力。
6 Masui 和Markert推断细胞质的实质是：即作为促成熟因子诱导受体卵母细胞成熟。这就是现在为人所知的MPF 三、 1 因为那时“MPF与诱导卵母细胞成熟有很大关系”只是假设，所以开始的时候，人们对MPF作用机制和其实质几乎没怎么关注 2 Willian Wasserman 和Dennis Smith (Puidue大学) 1978发表一篇关于MPF在早期两栖动物发育过程中的行为报告

30 3 他们推断：MPF在早期胚胎中表现的活性只是在卵母细胞中显示出的活性的剩余部分
4 但Wasserman和Smith发现MPF的活性在与细胞周期的变化相关的卵裂过程中表现出明显的波动 5 例如人们发现从受精后30-60min内正在分裂的蛙卵中取出的细胞质表现出很小甚至不表现出可以被人们发现的MPF活性（通过将未成熟的卵母细胞注射进去进行化验得知）

31 6 但是如果细胞质是在受精之后的第90分钟从受精卵中取出来的，那么就能够再次发现MPF的活性

32 10 在爪蟾的卵中发现了相似的实验结果，只是MPF 活性的波动比在Rana中更迅速，与此活性相关的是：在爪蟾早期胚胎中受精卵分裂速率更快

33 四、很显然，相同的MPF活性时间不仅局限在两栖动物的卵和卵母细胞中，而且表现在许多类生物中
3 伴随着细胞周期的哺乳动物的MPF的活性波动，和正在分裂的两栖动物卵里的MPF的活性波动是一致的

34 4 从培养的Hela细胞(人宫颈癌上皮细胞, 1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成)的G1早期、G2晚期、或者s期提取的物质没有MPF活性
5 在G2早期，MPF出现；G2晚期MPF显著上升；在有丝分裂期MPF到达尖峰

35 五、在研究海胆胚胎过程中发现了另一个调控细胞周期的因素
2 海胆的卵是研究细胞分裂的一个很合适的材料，因为受精后的细胞有丝分裂非常迅速，具有高度可预知的时间间隔 3 如果将海胆卵放在加有抑制剂的海水中受精（这种抑制剂能抑制蛋白质的合成）卵将不能进行第一次有丝分裂，而是停留在染色质紧缩状态之前，且核被膜解体

36 4 简单来说在正常分裂发生之前，如果将蛋白合成抑制剂加入到媒介中，有丝分裂的每个阶段都会被阻碍
5 这些发现表明，想要有丝分裂发生，在早期细胞周期的每个阶段必须有一种或多种蛋白质的合成 6 但是，关于海胆卵分裂的早期研究没能揭示这一时期新蛋白质的出现

37 六、1983 Tim Hunt 和他的同事在Wood Hole Marine Biological 实验室。
报道了在受精的海胆卵细胞中合成的几种蛋白质（而不是未受精的） 2 为了更深入地研究这些蛋白质，他们在含有[35S]标记的甲硫氨酸的海水中孵化了受精卵。受精后在第16分钟之后的每10分钟间隔里取样品 3 从样品中得到的粗蛋白提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 标记的蛋白质通过放射显影定位 4 来自受精卵的提取物跑出几条显著的带被[35S]标记了，而等量的来自未受精的卵的提取物没有跑出明显带标记的带

38 5 其中表现出明显标记的一条带在受精后的85min时 从凝胶上消失了，这表明蛋白质被选择性降解

39 7 蛋白质数量的波动在Figue4中表示出来，它表明了第一次两个细胞分裂的时间过程分裂指数 P621

40 11 随后的研究表明：有两种不同的周期蛋白A和B在细胞周期的不同时间降解
8 蛋白质降解几乎和细胞的第一次第二次分裂同一时间发生 9 一种相似的蛋白质在surf clam（蛤）的卵中发现（这种无脊椎动物的卵被人们广泛应用于研究） 10 Hunt和他的同事将这种蛋白质称为“周期蛋白”，并且指出在周期蛋白水平的波动跟早期研究中MPF活性之间有明显的相似物存在 11 随后的研究表明：有两种不同的周期蛋白A和B在细胞周期的不同时间降解 12 周期蛋白A在中期开始向后期转变的5-6分钟内降解。周期蛋白B在此转变之后的几分钟内降解

41 七、Joan Ruderman和她的同事（Woods Hole Biological Laboratory的）证明了周期蛋白和MPF之间的第一次明显联系
2 在这项研究中，由带有全部周期蛋白A编码序列的克隆DNA片断在体外转录出编码周期蛋白A的mRNA 3 通过体外对mRNA进行翻译检验发现它编码surf clam （蛤）周期蛋白A 4 当合成的周期蛋白mRN A被注入到爪蟾的卵母细胞中，细胞中出现生发泡裂解和染色体浓缩，这个时间过程类似于经过孕酮处理诱导的那样

42 Figure5

43 5 这些结果表明：发生在减数分裂和有丝分裂期间正常的周期蛋白A的增加对于促进细胞进入M期有直接作用

44 八、 1 但是，周期蛋白和MPF之间是什么关系呢？ 2 解决这个问题遇到的困难之一就是不同种生物的影响 3 MPF最初是在两栖动物中研究的，而周期蛋白是在海胆和clams中研究 4 有证据表明在蛙卵母细胞中存在一个非活性的MPF分子前体库，在第一次减数分裂期间可以转变为有活性的MPF

45 5 另一方面，周期蛋白在clam卵母细胞中完全看不到，但受精之后不久便会出现
6 Ruderman想到周期蛋白A是MPF的活化状态 九、1 与此同时，另一个关于“纯化和描述MPF活性物质的实质”的研究开始了

46 3 纯化的MPF的注射物除了刺激卵母细胞成熟外还刺激进入两栖动物卵母细胞的蛋白质中
1980 California大学的Micheal Wu和John Gerhart Berkeley通过铵盐沉降蛋白质，在柱层析仪中加入再溶解物质，提纯了MPF的20-30折叠部分 3 纯化的MPF的注射物除了刺激卵母细胞成熟外还刺激进入两栖动物卵母细胞的蛋白质中 4 当部分纯化的MPF制剂和[32P]ATP在体外培养时蛋白质发生磷酸化，这表明，MPF作为一种蛋白激酶诱导成熟

47 十、 1988年，经过6步成功的层析，MPF被最后纯化出来
2 在这些纯化的制剂中，MPF的活性与两个多肽有关，一条多肽分子量是32KD，另一条多肽分子量为45KD 3 纯化的MPF制剂具有较高水平的蛋白激酶活性，能够利用带有放射性[32P]的ATP合成蛋白质 4 当纯化的制剂被培养在[32P]ATP中，发现45KD的多肽被标记上

48 十一、1 到1980年末，揭示周期蛋白MPF作用的研究渐渐与另一个关于裂殖酵母的研究融合到一起，这个裂殖酵母的研究是由Oxford大学的Paul Nurse 和他的同事做的
2 研究表明酵母产生一种分子量为34KD的蛋白激酶，这种蛋白激酶的活性是细胞进入M期所必需的 3 这种酵母蛋白质被称为p34cdc2或简单称为cdc2

49 4 酵母与两栖动物研究小组的合并，第一次发现cdc2与MPF相联系的证据
5 以前研究表明：MPF包括32KD和45KD两种蛋白质， 6与裂殖酵母中的cdc2相抗作用的抗体能够与从爪蟾卵中分离的MPF中32KD的组分特异反应 7 这些发现表明，MPF的这一组分与34KD的酵母激酶是同族体（homologue），并且在酵母和脊椎动物中控制细胞周期的machrnery 包括进化中的保守成分

50 十二、 利用抗酵母cdc2的抗体进行的一项类似的研究表明：在细胞周期中，脊椎动物同源蛋白质并不发生波动
2 这个发现支持了另一种假设：在脊椎动物体内32KD的蛋白激酶依赖于另一种蛋白质 3 人们推测调节者是在细胞周期里集中上升并在分裂末期降解的周期蛋白 4 这一推测在后来的一系列试验中被证实，通过分析从两栖类clams（蛤）、海星中纯化的MPF的多肽组分研究证实

51 5在动物细胞M期内出现的有活性的MPF是一种含有两类亚基的复合物（1）一种是含有蛋白激酶活性的跟酵母的cdc2蛋白激酶同源的分子量为34KD的亚基（2）一个是45KD的大亚基，这种周期蛋白是激酶具有活性的必需条件 6 这次试验途径提供了一个关于所有真核生物细胞周期控制的独特观点 7 而且他们的结论建立在对大量控制MPF(cdc2)活性的因子的分析基础上，包括在酵母和哺乳动物细胞周期的各个时期的MPF活性状况，这也是过去几年的研究热点

52 谢谢！