流式细胞术 （ Flow Cytometry ,FCM）.

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1 流式细胞术 （ Flow Cytometry ,FCM）

2 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。

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5 荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。

6 标本处理 免疫荧光标记 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记

7 （一）直接免疫荧光标记法 流式细胞术常规检测时的样品制备
 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入) 。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

8 直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

9 (二)间接免疫荧光标记法  取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

10 本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

11 最小化非特异性结合的方法

12 常用的荧光染料（488波长激发） 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色
PE(RD1) 免疫荧光 橙色 ECD 免疫荧光 橙红 PeCy 免疫荧光 红 PI DNA染色 橙红 PECy 免疫荧光 深红 7AAD 区分死细胞 其中PE最强，使用于弱表达抗原 FITC最便宜，使用于强表达抗原

13 培养细胞 制作细胞悬液 目滤网过滤 免疫荧光标记 上机

14 流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨
应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=263.63,P＜0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P＜0.001).EDTA组、细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光强度表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:EDTA联合细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法

15 操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为 　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min 　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min 　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液) 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 　　　　　　　　　　(标本在试管中可保存5～7天)

16 1. DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至1000ml Na２HPO４ 11
1. DPBS (×10, 贮存液) 　　　　NaCl 80g 　　　　KCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000ml 　　　　Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释 　　　　KH２PO４ 2g 　　2.　洗涤液 　　　　DPBS　　　　　　900ml 　　　　FCS 50ml (终浓度　5％) 　　　　4％NaN３50ml (终浓度0.2％) 　　3.　固定液 　　　　DPBS　　　　1000ml 　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％) 　　　　甲　醛　　　　10ml 　　　　NaN３　　　0.2g (终浓度0.02％)

17 注意事项 　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 　　2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

18 注意事项 细胞数目，标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在100-200微升。 必须经过微栅过滤。 培养细胞类型，大小。
注意孵育条件，试剂说明上都有标记，大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4℃条件下孵育。 阴性对照。

19 血细胞 流式检测 抗凝。 除红细胞标记检测外需要溶血。 血标本取出后6小时内进行荧光染料标记，溶血固定后（含多聚甲醛）可保存2-3天。
注意孵育环境，试剂说明上都有标记，大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4℃条件下孵育。 标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在 微升。 如血标本中有血凝块或其他絮状物、沉淀不可上机检测，以防止堵塞流路通道。

20 氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)
贮存液(10′)： 80.2g NH4Cl (1.5M) 8.4g NaHCO3(100mM) 3.7g EDTA Na2(10mM) 蒸馏水900 ml 调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH) 加蒸馏水至1升 4oC保存6个月以内 工作液(1′)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存 注: 1) 贮存液不可小于10′, 否则会形成碳酸铵而失效 2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代

21 用氯化铵溶血剂的溶血方法 100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀 2) 避光孵育10~15分钟 3) 离心, 去上清, PBS洗2次 4) 抗体染色后, PBS洗 5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上机检测

22 细胞凋亡 流式检测 固定细胞的染色方法 非固定细胞的染色方法

23 固定细胞的染色方法

24 PI单染色法 （1） 1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。 4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。 6．用1ml PI染液，4℃避光30min。 7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

25 PI单染色法 （2） 1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 2．1ml PBS/FCS洗一次。
3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。 4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。 5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 6．400目的筛网过滤1次。 7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

26 调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析 1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。 2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。 4．PBS轻洗1次 5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。 6．PBS轻洗1次。 7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 10．  流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。

27 ISNT的流式细胞仪分析 1．离心收集细胞，PBS洗1～2次 2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。 4．PBS轻洗1次。 5．2×105细胞与12.5μl的缺口平移缓冲液在15℃共孵育6h，每过15min振动1次。 6．PBS轻洗1次。 7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 10．  流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图

28 非固定细胞的染色方法

29 Hoechst 33342/PI双染色法 1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。 2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 4．400目的筛网过滤1次。 5．流式细胞仪分析。

30 Annexin V/PI双染色法 1．细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，500～1000r/min离心5min弃去培养液。 2．用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。 3．用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。 4．500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。 5．加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

31 细胞因子检测 常用的标本类型和处理方法 全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。 细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。 冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

32 流式检测细胞染色基本过程（以全血为例） 1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时 2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色 ①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。 ②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断 3、细胞表面染色 ①加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟； ②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。） ③离心500g 5分钟，弃上清 4、固定和破膜 ①加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清； ②加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书） ③加2~3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。 5、细胞内染色 ①加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。 ②加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机

33 流式细胞术分析血小板 全血样本的制备 1.抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。 2.Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 3.1%多聚甲醛固定样本。 4.上机检测

34 质控标本 .阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。 2. 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。 3. 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。 4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照

35 流式细胞仪的调试和使用 ①打开电源，对系统进行预热； ②打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；
②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统； ③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统； ④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小； ⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程； ⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统； ⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量 大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理； ⑧将所需结果打印出来。

36 在操作和使用中一定要注意如下事项：　 1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽； 　　2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常； 　　3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒； 　　4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等； 　　5）特别强度每次测量都需要对照组。

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