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植物细胞工程基本原理 植物细胞全能性 植物细胞的分化 离体培养条件下植物细胞的脱分化和再分化 器官发生 植物体细胞胚胎(胚状体)发生及其途径
影响植物体细胞胚发生的因素
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植物细胞全能性(totipotent) 在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官分化和再生，成为具有与母体植株相同遗传信息的植株的能力。 植物细胞全能性的相对性 不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应； 动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。 细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。
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植物细胞分化 基因的差异性表达，即为细胞分化；具体表现为内部生理变化和外部形态变化。
细胞分化使细胞功能趋于专门化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是进化的表现,越高级的植物类群,分化水平越高,细胞分工越细,机体代谢水平也越高。
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离体条件下植物细胞的脱分化和再分化 细胞脱分化和再分化的概念 细胞全能性与脱分化和再分化的关系
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细胞脱分化（dedifferentiation)
是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。 Flash 细胞脱分化阶段 启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现； 演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体； 脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。
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愈伤组织(callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。
草莓 烟草
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细胞再分化（redifferentiation)：
脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体的过程。 极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。 在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。
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细胞全能性与脱分化和再分化的关系 细胞全能性 脱分化 细胞分裂 再分化 个体再生 细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。
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器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。 通过器官发生形成再生植株有三种方式：
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先芽后根
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先根后芽
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在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。
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植株再生 两种途径： 器官发生途径: 根芽器官直接分化形成植株 体细胞胚胎发生途径: 产生具有胚芽、胚根的胚状体结构再形成植株
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植物体细胞胚胎发生 胚状体：（embryoid）亦称体细胞胚或体胚。在体外，由体细胞（非合子细胞）经胚胎发育产生的类似胚胎的结构。
其发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段。 在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或外植体的维管束无直接联系 胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织中取得营养。 很容易从愈伤组织的表面脱离下来，在适宜条件下长成一株植物。
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魔 芋 体 细 胞 胚 魔芋
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如何鉴别胚状体？ （I） 与器官发生形成个体的途径相比： 胚状体具双极性（double polarity）
生理隔离（physiological isolation） 遗传性相对稳定 由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成的再生植株，其遗传特性相对稳定。 重演受精卵形态发生的特性。
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如何鉴别胚状体？ （II） 与合子胚相比： 合子胚在发育初期具有明显胚柄，体细胞胚没有真正的胚柄
合子胚的子叶是相当规范的，要以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范，有时具有两片以上的子叶 与相同植物相比，体细胞胚体积明显小于合子胚 体细胞胚没有休眠，而合子胚胚胎发育完全进入子叶期以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。
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类似于动物胚胎早期的发育 发育早期2次均等分裂 胚胎细胞发生 胚结构形成
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体细胞胚胎发生途径 胚状体可从离体培养的各种外植体上直接或间接地发生，大致分为五种： 直接从器官外植体上发生(以叶片为例） 愈伤组织发生
悬浮培养细胞发生 单倍体细胞发生 原生质体发生
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体细胞胚胎发生途径1：叶片 兰草 诱导阶段 胚胎发育阶段 (兰草,Chen等,1999)
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体细胞胚胎发生途径2：愈伤组织 蝴蝶兰,Lin等,2000 愈伤组织胚性化 诱导愈伤组织形成 子叶胚期 球形胚形成
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蝴蝶兰
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体细胞胚胎发生途径3：（悬浮细胞） 悬浮液中有两类细胞： 不具备胚胎发生潜力（自由分散、大、高度液泡化） 具备成胚能力的胚性细胞团（成簇成团、小、胞质致密） 发生过程：胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形期等发育阶段形成完整的体细胞胚。
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悬浮细胞体细胞胚发生过程 胚性愈伤组织 悬浮培养的胚性细胞团 愈伤组织 成熟子叶胚 球形胚形成
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影响体细胞胚发生的因素 1.生长调节物质 (1)生长素类: (例）在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程,每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养，通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.5～1mg/L。在这样一种培养上,愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团,称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代,胚性细胞团的数量不断增加,但并不出现成熟的胚。然而,如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养上,它们就能发育为成熟的胚。
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(2)细胞分裂素类: 既或促进也可抑制体细胞胚的发生,这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用,特别有利于子叶的发育。另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性,如在胡萝卜的研究中发现,虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为0.1μM的玉米素却能促进这个过程,而6-BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。
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小麦、石刁柏、颠茄则要在适当浓度的生长素和较高浓度的激动素时才能分化出胚状体
(3)赤霉素类: 赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生,但对于许多植物而言,赤霉素对于体细胞胚的成熟与萌发有促进作用。 (4)脱落酸: 抑制剂特别是ABA,在体细胞胚发生过程中的作用正逐渐被提示出来,ABA是一种天然产生的生长调节剂,当把无抑制作用剂量(通常是0.1～1μM)的ABA用于荷兰芹属培养物时,可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制不定胚的启动。 小麦、石刁柏、颠茄则要在适当浓度的生长素和较高浓度的激动素时才能分化出胚状体
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石刁柏 颠茄
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2.氮源 氮源有还原态氮(NH4+)和氧化态氮(NO3-)两种
在以KNO3为唯一氮源(如White培养基)的培养上建立起来的愈伤组织,去掉生长素以后不能形成胚。 德国Reinert等在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培养基均为White培养基)得到以下结果: [NH4+] (mM) [NO3-] (mM) 体胚发生数 (个/2ml) 10 40 1131±219 55 19±0.3 95 11.3±4.1
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3.低温预处理 低温(3℃）对四季橘花粉胚形成的影响 处理时间（天） 培养花粉 花胚状体 （枚） (个) (％) 848 8 0.94 5
848 8 0.94 5 723 12 1.66 10 902 15 846 0.59 20 470 2 0.43 25 434 3 0.69
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4.植物的遗传性 一个离体培养的烟草花药，可以产生200个体细胞胚。 花药培养中胚状体诱导率比较 诱导率（％） 烟草 >30 柑桔
0.43%~1.66% 白菜 1.1%~1.68%
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苹果品种间花药培养胚状体发生频率比较 品种 发生频率（％） 元帅 1.9%~2.5% 国光 0.0%~1.2% 金冠 0.2%~3.4%
赤阳 0.3%~1.5%
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生理状态对体细胞胚形成的影响
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生理状态对体细胞胚形成的影响 如毛果杨花药诱导在不同年份效果截然不同
以叶片为诱导材料的:黑杨x辽杨以组培苗的针刺叶片为材料，才能诱导出胚性愈伤组织 N C 取组培苗未展开的叶片。 缘毛杨需先进行BA长时期暗培养。 因此，对外植体材料进行适当的选择或前处理，有利于体细胞胚的诱导。 －－:于志水，男，1977年10月生，北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室，硕士研究生。杨树体细胞胚胎发生研究概况,东北林业大学学报
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无机盐 有机物 营养条件 激素 天然复合物 外因 渗透压 酸碱度 湿度 环境条件 影响因子 温度 光照 遗传性状 内因 生理状态
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小结 细胞全能性是细胞工程的基本理论基础 细胞全能性的表达能力与细胞分化有关 离体培养下细胞全能性表达是通过细胞脱分化和再分化实现的
器官发生和体细胞胚发生是植物细胞再生个体的基本途径
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思考题 1．概念:细胞全能性、脱分化、再分化、愈伤组织、胚状体。 2．细胞分化的阶段及细胞结构的变化。 3. 植物细胞脱分化能力有什么特点？
4．离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。 5．如何鉴别胚状体。 6．体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。 7．影响体细胞胚形成的因素及调控。
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