新药研究概论 （Outline of Drug Research）

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1 新药研究概论 （Outline of Drug Research）
第一节 引言（Introduction）

2 一、新药的研究与开发 新药的创制分研究阶段与开发阶段 (划分是候选药物的遴选与确定) 研究阶段 研究阶段强调学术和技术意义 开发阶段
开发阶段则强调市场价值和经济意义 药物分子设计（Molecular drug design）是指通过科学的构思和理论的规划，构建具有预期药理活性的新化学实体（New chemical entities, NCE）的分子操作

3 二、创制新药的四要素 ① 药物作用靶标的确定 ②活性评价系统的建立 ③先导化合物（Lead compound，先导物）的发现；
④先导化合物的优化

4 靶标的确定 确定治疗的疾病目标和药物作用的环节和靶标，是创制新药的出发点，因为以后实施的各种操作都是由此决定的。选择病种和靶标，除旨在创制非盈利和社会公益性药物外，应以市场的需求、容量和投入回报为导向。新颖的靶标意味着新的环节和机理，创制的药物往往有较强的市场竞争力，当然也要承担相当的风险。例如过氧化酶体增殖受体（PPAR）的发现，已经成为研制抗II型糖尿病和肥胖病药物的靶标，并陆续有新药上市。但是新的靶标很容易成为竞相开发之的，药物市场饱和以后，继续研制同类药物的前途未必看好。

5 模型的建立 靶标选定之后，要建立生物学模型，以筛选和评价化合物的活性。模型可有不同的层次，例如体外的分子水平（酶或受体）试验、细胞培养、对离体器官的作用，以及对整体动物的体内试验，这些模型均应反映出是针对所选定的靶标的作用。通常要制定出筛选标准，如果化合物符合这些标准，则研究项目继续进行；若未能满足标准，则应尽早终止研究。

6 先导物的发现 新药研究的物质准备是化合物的搜集和制备，通过活性筛选，对达到所设定活性指标的化合物，定为入选的苗头化合物（Hit），再经不同的模型和提高活性强度的标准，以及化合物的结构类型和专利考虑等多种因素，从苗头化合物中确定先导化合物，这就是先导化合物的发现（Lead discovery）。先导化合物是指新发现的对某种靶标和模型呈现明确药理活性的化合物。先导物可以是已知的化合物，但其活性应是新发现的。当然，先导物的化学结构最好也是新颖的。先导物可以从多方面的来源得到：天然产物，化学合成化合物，生物合成化合物等。

7 先导物的优化 先导化合物的优化（Lead optimization）。先导物优化的特征是建立结构与活性的关系，简称构效关系（Structure-activity relationship, SAR）。这里所说的活性是泛指的生物活性，包括了药效、药代、毒性等。构效关系的研究可以是定性的评价，也可以是定量的研究，后者又分为二维和三维定量构效关系研究（2D-, 3D-QSAR）。 研究构效关是实验性的总结和概括，但构效关系的方法学和参数的研究，有许多理论问题。通过构效分析，进一步指导设计与合成，再经体内外活性评价，循环反馈，最终获得优化好的化合物—候选药物（Drug candidate）。

8 三、药物分子设计的策略基础 药物分子设计的方法很多，例如从天然活性产物，组合化学方法，基于受体结构的药物设计，虚拟筛选，定量构效关系，传统药物化学方法等，广泛用于先导物的发现和优化。分析这些方法的内在联系，可认为分子的多样性（Diversity），互补性（Complementarity）和相似性（Similarity）构成了设计方法的策略基础

9 第二节 分子的多样性－先导化合物的发现 （Molecular Diversity－Lead Discovery）
一、天然产物具有多样性，是先导化合物的重要来源 自然界生物的多样性决定了天然化合物的多样性。植物、动物、微生物以及海洋生物等在物竞天择的环境和进化过程中，为了自身的生存和种群的繁衍，制造了各色各样的代谢物质，这些物质往往会保护自己免被周围环境的生物或不适条件所毁灭。青霉菌产生青霉素并向周围分泌，抑制与其共存的“异己”生长；一些植物为了保存自己不被动物吃掉，产生诸如有强心作用的苷类或作用于中枢神经系统的生物碱，或产生有不愉快味道、引起呕吐的物质等；动物脏器中提炼的激素，虽然有些可直接作为药物，但更多作为先导物

10 青蒿素 古书记载我国西北部盛产的黄花蒿（Artemisia annua）有清热解毒的作用，基于此我国科学家发现了青蒿素（Artemisinin）具有强效抗疟活性。Artemisinin对于产生耐药作用的恶性疟原虫感染的患者，有明显的治疗作用。Artemisinin属于倍半萜类化合物，分子结构中含有过氧键，是呈现抗疟作用的药效基团，如果将过氧键还原成醚键，则完全丧失抗疟活性。然而，由于青蒿素的水溶性较低，体内吸收性能不好，以其为先导物进行结构优化，经过一系列的研究，得到了例如二氢青蒿素（Dihydroartemisinin）、蒿甲醚（Artemether）和青蒿琥酯（Artesunate）等优良药物

11 二氢青蒿素 （Dihydroartemisinin） 青蒿素（Artemisinin） 蒿甲醚（Artemether） 青蒿琥酯（Artesunate）

12 红霉素类 红霉素（Erythromycin）为含有14元环的内酯类抗生素，Erythromycin的强效抗菌作用，是通过抑制氨基酸酰化的t-RNA的易位，干扰核糖体的程序化合成蛋白。然而Erythromycin有明显的刺激胃肠道副作用，研究表明Erythromycin在胃酸的催化下，6位羟基与9位羰基形成半缩醛，继之与12位羟基生成缩酮，缩酮是产生胃肠道刺激和丧失抗菌作用的主要原因。为了避免缩酮的形成，将6位羟基甲基化，得到克拉霉素（Clarithromycin）。阿齐霉素（Azithromycin）和Telithromycin[2]的抗菌作用更强。

13 洛伐他汀 在生物的进化过程中，某些低等生物的次级代谢产物与哺乳动物的正常代谢产物有许多相似之处。例如自霉菌Penicillium citrinum发酵液中分离得到的洛伐他汀（Lovastatin）具有降低血液中胆固醇作用。Lovastatin分子中含有二羟基戊酸片段，与胆固醇在人体内生物合成的3-羟基-3-甲基戊二酸的结构有相似性，后者在HMG-辅酶A还原酶的催化下，被还原成甲羟戊酸（Mevalonic acid），这是体内合成胆固醇的级联反应的限速步骤。Lovastatin与酶的结合作用Ki值为1.0 nM，低于底物3-羟基-3-甲基戊二酸的Km值（10 μM）一万倍，

14 因而有很高的特异性抑制作用。Lovastatin分子中的六氢萘片断是维持与酶发生紧密结合的疏水性基团，对抑制作用起重要作用[4]。二羟基戊酸以开环的形式与酶相结合，内酯本身没有活性。六氢萘环对抑制过程起辅助作用，可用其他结构替换，例如氟伐他汀[5]（Fluvastatin）、阿托伐他汀[6]（Atorvastatin）和罗素他汀（Rosuvastatin）等分别用吲哚环、吡唑环和嘧啶环替代六氢萘环，仍有很强的抑制活性，但共同特点是有相当的疏水性

15 石杉碱 石杉科植物千层塔含有菲啶类生物碱石杉碱甲和乙（Huperzine A, Huperzine B），具有强效抑制乙酰胆碱酯酶的作用，可提高学习记忆和认知能力。临床用于治疗阿茨海默病、健忘症和重症肌无力[7]。为提高Huperzine A向中枢的分布，增加其脂溶性，将伯氨基制成芳香醛的西佛碱前药，有望成为新一代的抗老年痴呆药物。

16 Huperzine A抑制胆碱酯酶的IC50为114 nM, 其简化物氨基喹啉酮的抗胆碱酯酶活性较低，IC50为500 nM，用12个亚甲基连接两个氨基喹啉酮得到的化合物提高了抗胆碱酯酶活性，比Huperzine A强一倍（IC50＝52 nM）

17 二、组合化学 （Combinatorial chemistry）
基本原理 先导物的发现在很大程度上取决于化合物的合成和生物评价的速度，合成的数量越多，速率越快，发现活性化合物的概率越大。 组合化学作为一种化学合成方法，所实行的化学反应与传统的有机合成没有本质区别 组合化学的特点是在同一时刻实施相同类型的反应，制备出多个群集分子，这些化合物或呈混合状态制备，或以单个化合物方式存在。这样形成的化合物库，可进行群集的高通量筛选。组合化学与高通量筛选相配合，构成了发现或优化先导化合物新途径。

18 经典合成法与组合化学法比较 经典合成法 组合化学法

19 组合化学同传统有机合成的不同点是从一组化合物的结构分析并设计化合物的合成路线。将一组化合物的共同结构称作结构骨架（Scaffold）或结构模板（Template），连接于结构骨架的基团或片段是具有相同功能基的多种组建模块（Building block），连接的方式是通过同种成键反应实现的。所以，组合化学认为化合物是由连接于结构骨架上若干组建模块所组成的分子。组建模块越多，生成的化合物数量越大。组建模块的拼接可以成线性结合，生成的化合物成线性分子。

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21 合成组合库，可用固相法或液相的方法。固相合成（Solid-phase synthesis）是将反应物连接在树脂上，在连接的树脂上进行化学反应，常用于多步骤和重复性的合成反应，制备大容量的化合物库。由于中间体和产物与树脂相连，为使反应完全，常常可加入过量试剂，在反应后经简便地过滤和洗涤除去多余的试剂。当今的组合化学主要用固相有机合成，合成大容量化合物库的最有效方法是合－分法（或称混合－均分法，Split-pool method）

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23 制备3×3×3化合物库的模式图。可以看出，通过两次混合－均分的三次操作，共生成27个化合物，分布在三个容器中，每个容器中有9种化合物。合－分法得到一个树脂粒上只有一个化合物的混合物样品，可用多种方法进行生物学评价，虽然所得到的连接树脂的化合物可以用水溶性的酶或蛋白直接测定其活性，但最好将化合物切割下来,在溶液中测定活性。由于每组混合物的合成的最后一步所用的模块是确定的，这为揭示有活性化合物库的结构提供了很大方便

24 1、二肽肽酶IV抑制剂脂肪腈化合物库 二肽肽酶IV（Dipeptidyl peptidase IV, DPP-IV）是与II型糖尿病相关的靶标，为丝氨酸蛋白酶，在体内可使促胰岛素激素－胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1, GLP-1）失活，引起糖尿病。DPP-IV特异性地裂解GLP-1的N端二肽残基：Xaa-Pro或Xaa-Ala，Xaa为某一氨基酸。选择性地抑制DPP-IV酶，可延长GLP-1刺激胰岛素分泌的持续时间，抑制胰高血糖素的释放，减缓胃的排空，因而降低血糖水平。

25 模拟Xaa-Pro残基，得到环己基甘氨酰-2-氰基吡咯烷，N端的伯氨结合于酶的P2域，抑制DPP-IV的活性IC50=3 nM，进而认为N-取代的甘氨酰氰基吡咯烷活性更强，采取平行合成方法，将200种N-取代的甘氨酸与树脂连接的N-溴代乙酰基脯氨酸作亲核取代反应，裂解掉树脂，得到N-取代的甘氨酰脯氨酰胺库，在液相中以三氟乙酸酐脱水，再用氨中和得到目的库。

26 N-取代的甘氨酰氰基吡咯烷 环己基甘氨酰-2-氰基吡咯烷

27 IC50 = 7.0 nM（人血浆DPP-IV） IC50 = 8.7 nM（人血浆DPP-IV） 200个目的物中含硝基吡啶基的化合物对人血浆DPP-IV呈现强抑制作用，IC50 = 8.7 nM，为消除硝基潜在的毒性，经药物化学变换，得到氰基吡啶取代的甘氨酸化合物，IC50 = 7 nM，该化合物选择性很高，口服试验表明对大鼠和人DPP-IV抑制，可维持GLP-1水平4小时

28 2、依赖于周期蛋白的激酶4抑制剂 依赖于周期蛋白的激酶4（Cyclin-dependent kinase 4, CDK4）是与细胞周期相关的蛋白，经磷酸化可调节细胞内信号转导系统，与细胞的增殖密切相关。抑制CDK4，蛋白不能磷酸化，使细胞分裂停止在G1期，因而是癌化疗的靶标。Honma等将组合化学与基于受体结构的分子设计和经典的药物化学优化相结合，研究了CDK4酶的抑制剂

29 首先，根据CDK2的晶体结构用同源模建方法构建了CDK4三维结构。
其次，用LEGEND软件全新设计了1000个结合于深部狭窄的ATP作用部位，这1000个虚拟出的化合物均为全新分子。 然后，应用SEEDS程序剖析药效团，并以生成的药效团作为提问项，搜寻ACD库。挑选出4884个分子量低于350的化合物，其中可购买到的有380个，经CDK4筛选，18个苗头化合物的IC50为 μM。按照结构类型分为4类，结构为二芳基脲，环脲和环硫脲，氨基嘧啶和氨基三嗪，蝶啶

30 蝶啶 二芳基脲 环脲和环硫脲 氨基嘧啶和氨基三嗪 以二芳基脲为先导物合成的羟基萘甲基氯苯基脲，IC50 = 44 μM。变换甲基氯苯片断，合成了含有55个化合物的组合库，得到的含吡啶基的分子IC50 = 7.6 μM。 再以N,N′-萘酚基吡啶基脲为先导物，合成了含有410个分子的组合库，最终得到高选择性的CDK4抑制剂，IC50 = 42 nM。后者与CDK4的复合物单晶，经X-线衍射分析，表明该抑制剂所处的位置与ATP结合位点相同，证明了预期的结合模式

31 IC50 = 7.6 μM 410个化合物组合库 IC50 = 7.6 μM 55个化合物的组合库 IC50 = 44 μM
（对CDK2无活性） 410个化合物组合库 IC50 = 42 nM （对CDK2无活性）

32 三、组合生物合成 分子生物学和基因克隆技术的发展，使得科学家完全能够将长时间的缓慢的进化过程，在短时间内人为地再现或改变。通过对基因的不同组合方式，如混合、匹配、交换或突变，实现基因重组，并克隆到不同的生物体中，产生出新的酶系，从而催化生成新的代谢产物，这就是组合生物合成的基本原理

33 组合生物合成（Combinatorial biosynthesis）整合了基因重组技术与组合化学策略，将产生次级代谢产物的酶系编码的基因克隆到微生物细胞中，由于产生了多种变异的酶系，这会使该微生物产生多种本不存在的物质，即非天然的天然物质，实现分子的多样性。 聚酮（Polyketide）类化合物是一大类具有多样性结构的天然产物，大多是由放线菌或真菌产生的次级代谢产物。许多聚酮化合物具有抗菌或抗癌活性，例如红霉素、柔红霉素（Daunorubicin）、四环素、利福霉素（Rifamycin）、放线紫红素（Actinorhodin）等。在结构上聚酮可分为两类：大环内酯（Macrolides）和多环芳香酮

34 下面以红霉素为例，说明聚酮的生物合成过程。红霉素产生菌Saccharopolyspora erythraea含有聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）系，存在于6个结构单元（Modules）中，每个结构单元中含有多结构域的酶系[15]，聚酮合酶是催化该“组装线”的多功能活性中心的酶系。 每个结构单元负责将丙二酸辅酶A加到由丙酸辅酶A开始链上，增加一个三碳单元。结构单元无论是否含有酮还原酶，脱水酶和烯醇还原酶活性决定着链增长过程中对β羰基的处置程度，即它的氧化水平。图4-5是聚酮合酶催化合成红霉素的示意图，是在6个功能单元的作用下，由丙酸、丙二酸等小分子经Claisen样缩合、还原、脱水等循环反应，增长碳链，最后环合而成6-Deoxyerythronolide B，经糖化生成红霉素A。

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36 四、组合生物催化