复习内容 食品菌相 天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、FATM1。从结构上分B族、G族。毒性与危害。

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1 复习内容 食品菌相 天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、FATM1。从结构上分B族、G族。毒性与危害。
酶联免疫吸附测定原理

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3 课后复习 食品菌相 天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、FATM1，按照结构分为B族、G族；毒性。
酶联免疫吸附测定原理

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5 第三节 赭曲霉毒素A的检验 3.1 概述 3.2 薄层色谱法

6 3.1 概述 理化性质：赭曲霉毒素（ochratoxin）是由曲霉菌和青霉属的几个种属产生的有毒代谢产物。基本结构是异香豆素连接到β-苯丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四种化合物。其中赭曲霉毒素A （OTA）最重要。 OTB没有氯元素，OTC是A的乙酯，OTD是4-羟基A。 OTA酸性条件下溶于苯、三氯甲烷和稀碳酸氢钠溶液，加碱成盐，其盐溶于水。 主要来源：寒冷条件下由纯绿青霉产生，温暖气候下由赭曲霉产生。谷物、大豆和香辛料，特别是红辣椒易受污染。动物饲料优甚。

7 与人体健康关系：存在于动物的肾、肝、肌肉和血液中，猪是最敏感的动物，肾是主要靶器官。1956年巴尔干地方性肾病。特定的癌症基因变异，p53 「龙胆泻肝汤（丸）」，原药方以木通入药，至1983年因木通资源短缺，中国大陆地方标准便以关木通代替木通。关木通是马兜铃科草药，含马兜铃酸，2003年底 。 卫生标准：食品中没有限量标准。 分析方法：薄层色谱法、HPLC、ELISA。

8 3.2 薄层色谱法 原理：用三氯甲烷-磷酸（0.1mol/L）或石油醚-甲醇/水提取样品中OTA，净化浓缩后薄板展开，根据样品在紫外光灯下，OTA标准点相应处产生黄绿色荧光的强度，与标准比较确定含量。 样品处理：样品用三氯甲烷和0.1mol/L磷酸提取，OTA在酸性条件下进入有机相，过滤加碳酸氢钠溶液碱化，OTA进入水相分离后碳酸氢钠水层用稀盐酸溶液调节pH2-3，用三氯甲烷振摇提取分层后，挥干三氯甲烷加入苯-乙腈（98＋2）溶解残渣，供TLC用。

9 测定方法：滴加标准、样品、样品＋标准三个点。先用横展剂乙醚或乙醚-甲醇-水（94＋5＋1），将薄层板纵展2-3cm，此时OTA不动而杂质向前移动。取出挥干，再将该薄层板靠近标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂进行横展，使杂质偏离点样点，与OTA 分离，避免了杂质荧光的干扰。然后将经横展后的薄层板纵展，纵展剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6＋3＋1.2＋0.06）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6＋3＋1.4），苯-冰乙酸（9＋1）。365nm下紫外观察，若与标准点处有荧光点则估计稀释倍数，再点样。同时做确证实验。

10 确证实验：用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒薄层色谱板，干燥于长波紫外灯下观察，这时OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加。
方法说明：点样量若超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留的溶剂在横展中可将OTA点横向拉长，可根据荧光强度于标准对比，估计减少的加样体积或所需稀释的倍数；OTA标准液应用黑纸遮光；最低检出限为10ppb。

11 第四节 展青霉素的检验 4.1 概述 4.2 双向薄层扫描测定法

12 4.1概述 理化性质：展青霉素（patulin）为无色结晶，70-100℃可升华，分子式C7H6O4，溶于水和乙醇。在碱性溶液中很不稳定，酸性溶液中较稳定，耐热。

13 展青霉素（Patulin, Pat) OH 结构 O O O

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15 展青霉素（Patulin, Pat)毒性 3. 毒性作用 (1) 急性和亚急性毒性
3. 毒性作用 (1) 急性和亚急性毒性 啮齿类动物的急性毒性中毒：痉挛、肺出血、皮下组织水肿、无尿，死亡。   (2) 致癌、致畸和致突变性 皮下注射部位引起雄性大白鼠发生局部肉瘤，经口服的实验动物未发现致癌现象。Pat对大鼠和小鼠没有致畸作用，但对鸡胚有明显的致畸作用。

16 展青霉素（Patulin, Pat)毒性 (3) 细胞毒性：Pat能改变细胞膜的通透性，更利于K+外流。
(4) 对免疫系统的影响：亚致死剂量的Pat对小鼠和兔的免疫系统均有影响，Pat的免疫抑制作用是可逆的而且Pat对免疫球蛋白水平的影响具有时间依赖性。

17 展青霉素的污染 食品中的主要来源：是由荨麻青素、扩张青素和棒曲霉等霉菌代谢产生的，存在于腐烂水果及果汁制品中。

18 苹果和山楂制品中展青霉素限量卫生标准 品 种 指标(μg/Kg ) ≤ 100 ≤ 50 半成品（原汁、原酱） 原汁、果酱 果酒 罐头
品 种 指标(μg/Kg ) 半成品（原汁、原酱） ≤ 100 原汁、果酱 ≤ 50 果酒 罐头 山楂条（饼）

19 4.2 双向薄层扫描测定法 原理：用乙酸乙酯提取果汁，用1.5％碳酸钠净化样品。经双向薄层展开分离后，用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。
样品处理：鲜果、果酱加适量无水硫酸钠研磨吸收多余水分，加乙酸乙酯震荡提取过滤，滤液加稀碳酸钠振摇去杂质，乙酸乙酯在水浴上真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷定容供TLC用。果汁、果酒直接提取。

20 测定：在薄板上滴加标准液、样品液。在样品点同一垂直线上距顶端2cm处点标准液，作为位置参考点。先用横展剂三氯甲烷-丙酮横向展开后再用甲苯-乙酸乙酯-甲酸纵向展开，254nm下观察，若在Rf 0.35处有黑色斑点需做确证实验。将薄板喷3-甲基，2-苯并噻唑酮腙盐酸溶液，135℃烘烤15min，360nm下观察，呈橙黄色斑点即可确认。稀释后点样使其在线性范围内，双向展开后进行扫描定量。 最低检出限3μg/L。

21 水解产物与标准葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖溶液对照进行薄板层析，展开剂为正丁醇：无水乙醇（酸）：水＝4:1:5（V/V，上层液），以苯胺－邻苯二甲酸为显色剂，得到右图。
图3.9 β-(1,3)-D-葡聚糖水解产物的层析

22 镰刀菌毒素 1. 单端孢霉烯族类 （T-2毒素、脱氧雪腐镰孢菌烯醇等） 2. 玉米赤霉烯酮类 3. 丁烯酸内酯 4. 串珠镰刀菌素

23 单端孢霉烯族化合物 1）主要产毒菌株：镰刀菌属 2）结构与性质 基本结构：倍半萜烯 毒性化学结构：C－12，C－13环氧基 3）性质：稳定、烹调过程不易破坏 碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性。

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25 单端孢霉烯族化合物种类与毒性 种类：40余种 毒性作用：
共同特点表现为较强的细胞毒性、免疫抑制及致畸作用，部分有较弱的致癌性， 急性毒性强，可致人与动物的呕吐。

26 第五节 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验
第五节 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验 5.1 概述 5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法 5.3 酶联免疫吸附测定法 5.4 薄层色谱法（同时测定）

27 5.1概述 理化性质：镰刀菌属产生的有毒代谢产物主要是单端孢霉素类，只含有C、H、O三种元素。谷物种天然污染的有A、B两型，12、13碳原子上形成的环氧基可能为毒性的化学基础。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，NIV）属B型结构式，DON的结构式中R1为-OH，R2为-H，R3、R4为-OH。分子式为C15H20O6，NIV分子式为C15H20O7，溶于甲醇、乙醇和水。

28 主要来源：主要是雪腐镰刀菌污染谷物和饲料的代谢产物。
毒性与危害：主要为细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。人中毒后易呕吐，又称呕吐毒素（vomitoxin）。 NIV在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强。 卫生标准：我国建议人食用谷物中DON ≤1mg/kg。 分析方法：我国规定标准为TLC和免疫测定法，其他有GC、HPLC和微柱法。

29 小麦、面粉、玉米及玉米粉中 DON 限量标准
品种 指标(μg/Kg ) 小麦 ≤ 1000 面粉 玉米 玉米粉

30 5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法 原理：谷物及其制品中的DON经提取、净化、浓缩后经硅胶展开，加热薄板。由于有三氯化铝因此在365nm紫外光下显蓝色荧光，与标准比较。 样品处理：提取，准确称取粉碎样品加三氯甲烷-无水乙醇（8＋2）提取，过滤后水浴挥干；净化，石油醚溶解残渣转入分液漏斗再用甲醇-水（4＋1）分次洗涤，转入同一漏斗振摇，DON留在甲醇-水层，油脂进入石油醚层，将甲醇-水层加入装有氧化铝和活性炭的层析柱再用甲醇-水（4＋1）洗脱；浓缩，洗脱液水浴挥干趁热加入乙酸乙酯加热至沸腾，将残渣中DON溶出，冷却后转入浓缩瓶浓缩定容。

31 测定方法：在硅胶板上点样液，同时在板上端与样品点相对位置上点一个标准点作为定位参考，用乙醚-丙酮（95＋5）或无水乙醚横展使DON偏离原点，挥干后再点上2个等量标准点，其中一个加上样液。用纵展开剂三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（75＋10＋15＋1）展开。晾干后365nm下观察，干扰点显蓝紫色荧光DON无荧光。将薄板130℃加热后冷却，再观察，DON和干扰点均有荧光且斑点明显分开。 横展后DON移动 cm。

32 5.3 酶联免疫吸附测定法 原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。 样品处理：同5.2，浓缩瓶95℃水浴挥干，用pH7.4含20％甲醇的碳酸盐缓冲液定容，供检测。 测定方法：同2.3，用酶标仪在波长450nm下测A值。

33 5.4 薄层色谱法（同时测定） 原理：同5.2 样品处理：提取，准确称取粉碎样品用甲醇-水（96＋4）提取2次过滤。加石油醚洗涤取甲醇-水层，水浴浓缩；净化，浓缩液加水稀释后加入XAD-4树脂，蒸馏水淋洗，用甲醇分次洗提毒素，水浴挥干用甲醇溶解 测定方法：取2块板同5.2处理。DON用乙醚横展NIV用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（4＋2.5＋3.5＋0.6）横展。再分别用三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）展开DON，用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（3＋2.5＋4.5＋1.2）展开NIV。

34 第六节 T-2毒素的检验 6.1 概述 6.2 酶联免疫吸附测定法（间接法）

35 6.1 概述 理化性质：T-2毒素（T-2 toxin）属单端孢霉烯族化合物中的A型化合物，难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯。 T-2毒素的三甲硅衍生物具有强的特征质量碎片，可采用GC-质谱联用。 主要来源：三线镰刀菌和拟枝孢镰刀菌代谢产物。小麦、玉米、大麦和燕麦等。 毒性与危害：严重可引起死亡。 卫生标准：我国小麦、玉米及制品低于1000ppb。 分析方法：ELISA、TLC、GC等。

36 T-2毒素

37 6.2 酶联免疫吸附测定法（间接法） 原理：同2.3或5.3 样品处理：同5.3 测定：同5.3

38 第七节 玉米赤霉烯酮的检验 7.1 概述 7.2 分析方法

39 7.1 概述 理化性质：玉米赤霉烯酮（zearalenone ，ZEN），又称F-2毒素，ZEN白色结晶，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈，不溶于水、二硫化碳，短波紫外光下呈绿色荧光。对热稳定。 毒性与危害：类雌激素有毒物质。 卫生标准：我国未制定。 分析方法：TLC、GC、ELISA、HPLC等。

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41 主要来源：镰刀菌，污染玉米、小麦、大麦、燕麦、小 米、芝麻、干草和青贮饲料等。

42 7.2 分析方法 原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，经异辛烷脱酯、无水硫酸钠脱水、浓缩至干。残渣三氯甲烷溶解，溶液经硅胶柱净化，薄板分离，用薄层扫描仪测定。 样品处理：提取，试样用乙腈和4％氯化钾提取，滤液加异辛烷洗涤，乙腈层经无水硫酸钠脱水浓缩，用少量三氯甲烷溶解残留物；净化，将溶液加入硅胶柱中用三氯甲烷-丙酮（8＋2）洗脱，水浴浓缩。 测定：取等量标样和样品液在硅胶板上点样，展开剂三氯甲烷-丙酮-乙酸-水（18＋2＋8＋1），薄层色谱扫描仪进行测定。

43 复习内容 NIV在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强。