生物技术概论 第五章：酶 工 程 Enzyme Engineering

Presentation on theme: "生物技术概论 第五章：酶 工 程 Enzyme Engineering"— Presentation transcript:

1 生物技术概论 第五章：酶 工 程 Enzyme Engineering

2 四大生物工程 基因工程 发酵工程 细胞工程 产物 酶工程 产品 产品

3 一、酶的概念 1、酶(enzyme)是催化剂(catalyst)
所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。 酶在化学反应中就是充当这样的角色。 酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。

4 2、酶是一种特殊的生物催化剂 酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1） 酶具有催化的高效性 酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反 应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。

5 （2） 酶具有催化的高度专一性(specificity)
酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。 酶作用的专一性主要表现在以下几个方面： a. 绝对专一性： 酶只能催化一种反应物发生反应的特性 如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。 b. 相对专一性： 酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。 如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。

6 c. 异构专一性： 酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。 如：延胡索酸（反丁烯二酸）酶只专一催化于L-苹果酸和反丁烯二酸，兼具立体异构与顺反异构专一性。

7 （3） 酶的化学本质是蛋白质 酶的化学本质是蛋白质，主要从以下几个方面来认识： a. 酶的化学本质是蛋白质的依据
ⅰ. 酶与蛋白质一样是高分子胶体物质，且为两性电解质。 ⅱ. 导致蛋白质变性的因素，如酸、碱、热、紫外线以及其他蛋白变性剂，也能使酶失活 ⅲ. 酶也能被蛋白水解酶水解而失去活性。 ⅳ. 对高纯化的酶进行组成分析，表明其或者是单纯蛋白，或者是蛋白质与其他小分子物质构成的络合物（即结合蛋白）。 ⅴ. 根据核酸酶（RNase）的一级结构，人们已经从氨基酸开始，人工合成了具有催化活性的蛋白质产物。 b. 结合有辅助因子的酶中，蛋白质是其高效和高度专一催化特性的主导因素 c. RNA性质的生物催化剂的发现，并未否定“酶的化学本质是蛋白质”的结论

8 综上，对于酶，可以有如下概念： 酶是一种由生物体产生的，具有高效和高度专一催化活性的，与生命活动密切相关的蛋白质性质的生物催化剂。

9 二、酶的分类与命名 1．酶的分类 酶的种类很多，目前发现的酶约有3700多种，为了更好地研究酶、应用酶，国际酶学委员会推荐了酶的分类系统，该系统根据酶的催化作用类型，将已知酶为六大类： （1）氧化还原酶类（Oxidoreductases） （2）转移酶类（Transferases） （3）水解酶类（Hydrolases） （4）裂合酶类（Lyases） （5）异构酶类（Isomerases） （6）合成酶类（Ligases或Synthetases）

10 惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。
2、酶的命名 酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。 乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸：NAD+氧化还原酶 惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。 乳酸：NAD+氧化还原酶 乳酸脱氢酶 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。

11 3．酶的标码 为了更简便清楚地识别每一种酶，国际酶学委员会对每一个酶都用4个数字进行编码，称为酶的标码。
如：醇脱氢酶，标码为 EC 已糖激酶，标码是 EC 其中EC代表酶委员会系统（Enzyme Commission），前三个数字分别表示酶所属的大类、亚类 、亚亚类，根据这三个数字，可以判断出酶的催化类型和性质。第四个数字表示该酶在亚亚类中占有的位置，有了这四个数字，就可确定具体的酶。

12 酶的标码 6.合成酶类(ligases) 连接C-C、C-N、C-S、C-O。 大类 亚类
1.氧化还原酶类（oxido-reduclases) 1.脱氢酶 2.氧化酶 3.过氧化酶 氧和酶 2.转移酶类(transferases) 1.一碳基转移酶 2.转磷酸基酶 3.转糖基酶 3.水解酶类(hydrolases) 水解 1.酯键 2.糖苷键 3.肽键 4.肽键以外的碳氮键 4.裂和酶类(lyases) 分解碳碳、碳氮、硫硫键等。 5.异构酶类(isomerases) 消旋、异构、变位酶 6.合成酶类(ligases) 连接C-C、C-N、C-S、C-O。

13 三、 酶的活力测定 1．酶活力的含义 2．酶的活力测定
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的化学反应进行的速度。反应速度越大，意味着酶活力越高。 2．酶的活力测定 测定酶活力，就是测定酶所反应的速度，并且是初速度。 （1）酶反应速度：指单位时间内底物的减少量或产物的增加量。 V ＝-ds/dt ＝dp/dt

14 (2) 测定方法： 酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便，准确。 酶活力测定主要包括两个阶段: 其一，酶与其作用底物反应一段时间； 其二，测定反应液中底物或产物变化的量。

15 酶活力测定的一般步骤： a. 根据酶的专一性，选择适宜的酶反应底物。 b. 根据资料或试验结果，确定酶促反应条件。 c. 在适宜条件下，进行酶反应，记下反应时间。 d. 反应一定时间后，终止反应，立即测定产物的生成量或底物的减少量。

16 终止酶反应的方法有： ① 反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活； ② 立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活； ③ 加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应； ④ 将取出的反应液立即置于冰粒堆中，或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至o℃以下等等。

17 测定反应液中物质变化量的方法： ① 光学检测法： 如：用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸(NPP)水解生成的对硝基酚的量。 ② 化学检测法： 如：用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量。

18 3．酶活力单位 酶活力的大小，可以酶活力单位表示。 （1） 1961国际酶学委员会规定：在25OC,各种最适条件下，一分钟内转化一个微摩尔底物所需的酶量为一个国际酶活单位（IU）。 （2）1972年，EC又推荐了一个新的酶活国际单位katal，符号为kat。 1个kat单位定义为： 在最适条件下，每秒钟能使1摩尔底物转换的酶量，有μkat、nkat、pkat 等单位。 1 kat=1mol/s=60mol/min=60×106μmol/min =6×107IU 1IU=1μmol/min=1/60 μmol/s=1/60 μkat=16.67nkat

19 四、酶工程的基本概念 1. 定义 酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。 2. 内容 3. 任务
1. 定义 酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。 2. 内容 酶工程研究的主要内容包括：酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶的分子修饰、酶和细胞的固定化、酶反应动力学和反应器、酶的应用等方面内容。 3. 任务 酶工程的任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。

20 4、酶工程的种类 酶工程主要分为化学酶工程和生物酶工程两类 a. 化学酶工程 又为初级酶工程，是酶学理论与化学工程技术相结合的产物。 化学酶工程研究的主要内容： （1）酶的制备工艺 （2）酶和细胞的固定化技术 （3）酶分子化学修饰 （4）人工酶的合成 （5）酶反应器、酶传感器 （6）酶的应用等。

21 b. 生物酶工程 是在化学酶工程基础上发展起来的，以酶学理论和以DNA重组 技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，又称为高级酶 工程（advanced enzyme engineering）。 生物酶工程研 究的主要内容： （1）克隆酶的生产： 即用DNA重组技术，大量生产酶。 （2）突变酶的生产： 即用蛋白质工程技术，定点改变酶结构基因，生产性能稳定，活性更 高的酶。 （3）新酶的生产： 即用蛋白质工程技术，设计新的酶结构基因，生产自然界中从未有过的性能稳定、活性更高的酶。

22 克隆酶的生产 例1：用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因，从人细胞转移到大肠杆菌细胞内，可以使大肠杆菌细胞生产尿激酶原。尿激酶酶原和尿激酶都是治疗血栓病的有效药物。 突变酶的生产 例2：酪氨酰-tRNA合成酶的突变酶，其为Ala 51取代了Thr 51，从而使该酶对底物ATP 的亲和活力提高了 100倍。

23 现代酶学研究主要沿着两个方向发展 （1）酶的分子生物学方向：其主要任务是要从分子水平上更深入揭示酶结构与功能的关系；酶催化机制和调节机制；酶与生命活动的关系等理论问题，进一步设计酶、改造酶、在基因水平上进行酶的调节控制。 （2）酶工程方向：其主要任务是研究如何经济有效地进行酶的生产、制备、应用，将基因工程、以及分子生物学的最新研究成果用于酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器等。

24 酶 酒 五、 酶的发现及研究历史 人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。
公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也 酶 酒

25 西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。 1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。

26 1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。
后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究， 1930年，证实酶是一种蛋白质； 80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶，这一发现开辟了酶学研究的新领域， 现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。

27 六、酶的应用历史 1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。
1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。 1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。 此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。

28 1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。
50年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。 50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。 60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。

29 1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。
1973年,千叶一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期. 80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。

30 在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。
60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变; 70年代,修饰剂的选用、修饰方法上有了新的发展。 此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究 ,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。

31 5.1 酶的发酵生产 酶的生产方法 酶的生产是指经过预先设计，通过人工操作控制而获得所需的酶的过程。酶的生产方法可分为： 一、提取法
二、发酵法 三、化学合成法

32 一、提取法 1. 提取法的含义： 采用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来。 2. 实例：
从动物胰脏中提取胰蛋白酶；从动物胃中提取胃蛋白酶；从木瓜中提取木瓜蛋白酶等 3. 提取法的特点： 提取法是最早采用的一种酶的生产方法，该法直接、简便易行，尤其适合动、植物资源丰富的地区。但动植物生长周期长，易受气候、地理环境的影响，不适于大规模工业化生产。且产品杂质较多，分离纯化困难。

33 二、发酵法 1. 发酵法含义： 利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得所需要的酶的方法。 2. 实例：
用桔青霉发酵生产磷酸二酯酶；黑曲霉发酵生产淀粉酶；链霉菌发酵生产葡萄糖异构酶等。 3. 发酵法特点： 产酶种类多，凡是动植物体内有的酶，几乎都可以从微生物中找到，并根据应用特点，筛选最佳产酶菌株。 繁殖快，生长周期短，培养简便，能通过控制培养条件提高酶产量。 可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想的菌株。

34 三、化学合成法 1. 化学合成法： 根据酶的一级结构，以氨基酸单体为底物，用化学的手段合成一个酶。 2. 实例：
1969年，美国首次用化学合成法得到核糖核酸酶 3. 特点： 合成成本高，难度大，以这条途径进行酶的生产还有许多经济和技术的问题有待解决。故该法目前仍停留在实验室阶段。

35 5.1.1优良产酶菌种的筛选 1、酶的生产菌 —— 先决条件，直接影响发酵的生产成本. 对生产菌的要求： 产量高（利用廉价原料，周期短）；
非病源菌； 生产菌要稳定； 最好分泌胞外酶。

36 2、主要产酶菌 大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。 枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。 啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。 曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。

37 5.1.2 基因工程菌的构建 所谓基因重组是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将所需要的基因（目的基因）重组到一个适宜的载体上，组成重组子，将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞目的的技术 。 利于克服上述基因突变预见性小、工作量大的不足，成为微生物发酵产酶菌改造的新途径，又可把有实用价值的人和动植物来源的酶基因引入微生物中，用微生物作为“工厂”生产天然来源不易得到的或纯度极底的酶。如组织型纤维蛋白溶酶原激活剂 （tpa)等

38 构建工程菌分为四步： 目的基因片断的产生和分离； 目的基因片断共价连接到载体上，即体外重组。 体外重组的杂合分子转入合适的宿主； 筛选和检测。

39 5.1.3 微生物酶的发酵生产 是在人为条件控制下，有目的地利用微生物产生酶。其过程包括： ※ 种子准备；
※ 种子准备； ※ 培养基配制：人工配制的用于细胞生长和发酵的各种营养物质的混合物，提供菌种必要而合理的营养物质，其组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因素等几个方面。 ※ 选用合适的培养方法以及发酵过程中各种条件的控制管理等几方面。

40 提高酶产量的方法 针对性的打破生物细胞内酶蛋白的合成机制，可以从两方面入手：  条件控制：发酵条件优化。
 条件控制：发酵条件优化。  遗传控制：包括基因突变和基因重组。

41 （一）发酵工艺的优化 1、培养基：碳源、氮源、无机盐和生长因子等；
2、pH值：与细胞生长繁殖及发酵产酶都有密切关系，并且在细胞生长繁殖和代谢物产生过程中往往会发生变化，所以必须进行必要的调控。还可以此改变各种酶产量比。 如何调控？ 3、温度： 是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素，不同细菌有各自不同的最适生长温度，在发酵的不同阶段培养基温度变化明显；产酶最适温度和细胞最适生长温度不同 ，故必须经常及时地进行温度调控。

42 4、溶解氧：根据细胞对溶解氧的需要量进行连
续不断的无菌空气供给，以使培养基中的溶解 氧维持在一定水平，保证碳源有氧降解。 5、发酵周期：作生长曲线和产酶曲线，确定放罐 时间，避免自溶。 总之，优良菌种的筛选、适宜条件的确定是获得高产酶的重要措施，能较大幅度提高酶产量，尽量挖掘微生物的产酶潜力。但是措施是有限的，并且是经验的，随机性大，单靠这些措施很不够。为了使酶产量有一个飞跃，要采取另外一些有效措施。

43 （二）、采用添加诱导物、解除组 遏物、流加等技术
（二）、采用添加诱导物、解除组 遏物、流加等技术 1、添加诱导物： 许多工业用酶（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半乳糖 苷酶等）都属诱导酶，对于诱导酶的发酵生产，添加适量 诱导物可使酶产量显著提高。 原理是，加入效应物与阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因 结合，使结构基因得以表达；实际工作中，关键是选择一 个恰当的诱导物、确定诱导浓度及诱导时间。

44 诱导物一般有以下几类：  难于被利用的底物，底物类似物或底物修饰物；  诱导物的前体；  胞外酶的作用产物； 诱导物添加的量和时间要通过实验确定。

45 2、降低阻遏浓度 引起阻遏的原因有两种： 尾产物阻遏：可去除尾产物或使其尽量少形 成，如添加尾产物类似物或抑制剂、采用营养缺 陷型菌株等； 分解代谢产物阻遏： A)、尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源； B)、流加。

46 3、添加表面活性剂促进酶分泌到胞外 细胞内酶含量提高到一定程度，会被胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂之类促进分泌剂，可使胞内酶未被分解即被释放到胞外(因为表面活性剂有助于改善细胞通透性，因而也可打破细胞内酶合成的“反馈平衡”)。 常用：Tween-80、Triton x-100等。

47 4、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质： 酶的激活剂或稳定剂； 产酶微生物的生长因子； 有害金属的螯合剂。

48 5.2 酶的分离提纯 是指把酶从组织、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。 分离纯化方法主要根据蛋白质的如下性质:
1、分子大小； 2、溶解度； 3、电荷； 4、吸附性质； 5、对其他分子（配基）的生物学亲和力。

49 遵循原则： 1、根据使用目的(工业用、分析用、医用）— 质量要求； 2、制备方法的经济性（符合步骤短、收率高、成 本低的要求）； 3、按蛋白质特性，操作要求： 低温、pH(4 -10)、表面变性、重金属、有机 溶剂、水质、辅因子、蛋白酶等； 4、根据酶的特点可采用： 选择性变性、亲和性、酶活性测定等特殊手段。

50 5.2.1酶制剂的制备 破碎细胞 溶剂抽提 离心分离 浓缩 干燥

51 5.2.2酶的纯化与精制 根据酶分子大小和形状的分离方法 离心分离 凝胶过滤 透析与超滤（膜分离）

52 1、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。

53 2、凝胶过滤 凝胶过滤又称凝胶层析或凝胶排阻层析。
色谱柱由溶胀的多孔性、亲水性凝胶填充，分子量大的只能沿溶胀胶粒间的孔隙随溶剂流动，而不能渗入凝胶内部，故移动速度快而先流出色谱柱；分子量小的则可渗入凝胶颗粒，故较后流出色谱柱。

54 凝胶过滤

55 分子筛— 凝胶过滤法

56 常用凝胶 葡聚糖凝胶：商品名Sephadex或Bio-gelA，它是由链状葡聚糖通过交联剂聚合而成；
琼脂糖凝胶：商品名Sepharose，是从海藻中提取出来的多糖混和物； 聚丙烯酰胺凝胶：商品名Bio-gelP，是丙烯酰胺和次甲基二丙烯酰胺聚合而成。

57 3、透析与超滤（膜分离） 膜分离的原理与一般过滤不一样，主要依赖于被分离物质分子量的大小，形状和性质的不同，在一定压差下，使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，使不同大小的分子得以分离。 膜分离通常是指外源加压的膜分离。

58 膜分离的基本类型 微孔过滤：操作压为1.15kg/cm2以下，膜的平均孔径 0.05~14m，用于分离的微粒或亚微粒子；
用于分离溶液中2~200nm的微粒子； 反渗析：操作压在30~120kg/cm2，其膜的平均孔径一般小于1nm ， 用于分离小分子溶质。 透析：利用扩散作用进行分离，不需加压，用于分离小分子物质

59 根据酶分子电荷性质的分离方法 离子交换层析 层析聚焦 电泳

60 离子交换层析 离子交换层析是利用在离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种物质的吸附力不同而使不同物质分离的方法。
离子交换剂分为两部分：一部分是不能移动的多价的高分子基团，构成骨架；另一部分是活性离子，它在树脂中进出发生离子交换。 活性离子是阳离子，能吸附阴离子的称为阳离子交换树脂；相反则称为阴离子交换树脂。

61 离子交换法

62 层析聚焦 依蛋白质等电点不同而进行分离的层析方法。待分 离的蛋白质样品上到以适当高pH缓冲液平衡的多缓
多缓冲离子交换剂有一定缓冲能力，流洗中可自动 形成逐渐下降的pH梯度，等电点各异的蛋白质则在 与其pI相应的pH从柱中先后洗出得以分离。

63 电泳 1. 凝胶电泳 以多孔凝胶作为支持物的电泳技术兼具电泳和分子筛作用，分离效果较好。
固定支持物首推聚丙烯酰胺凝胶。凝胶可制成垂直管状和水平板状，其中连续和不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS凝胶电泳最常用。

64 电泳法 上：凝胶电泳 左：纸电泳

65

66 凝胶电泳测分子量

67 2. 等电聚焦电泳 当等电点不同的蛋白质分子处于一个由阳极到阴极pH值梯度逐渐增加的介质中,并通以直流电,“聚焦”在与其等电点相同的pH值位置上，形成位置各异的不同区带，这种电泳方法称为等点聚焦电泳。 这种方法可以区分等电点只有0.01pH值单位差异的蛋白质。

68 电泳中pH值梯度的形成取决于两性蛋白质载体。在电泳系统中加入不同等电点的两性电解质载体，通入直流电后，即在电场作用下形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。
目前主要采用的商品载体两性电解质是Ampholine,它是一系列不同等电点的脂肪族多氨基多羧基同系物及异构物的混合物 。

69 5.2.2.3 根据酶分子专一性结合的分离方法 亲和层析 染料配体亲和层析 共价层析
生物高分子包括酶蛋白分子具有和某些对应的专一分子可逆结合的特征。例如：酶的活性部位能和底物、竞争性抑制剂、底物类似物以及辅助因子专一性地结合。同时，改变条件可以使这种结合解除。 亲和层析 染料配体亲和层析 共价层析

70 亲和层析

71 配基：具有可供偶联的活泼基团，结合后不会影响配基和酶之间的相互作用。
亲和层析过程： 1、 固定配基 2、装柱 3、吸附 4、解吸 载体：必须高度亲水，使蛋白质分子容易接近。（常用：琼脂糖凝胶） 配基：具有可供偶联的活泼基团，结合后不会影响配基和酶之间的相互作用。

72 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：
共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析

73 根据分配系数的分离方法 萃取分离：是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。 按照两相的组成不同，萃取可以分为： 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取

74 酶的组合分离纯化策略 设计分离纯化工艺的基本要求 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量）
Recovery（回收率）

75 酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。

76 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：
真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥

77 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。
酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶

78 5.2.3 酶的纯度与酶活力 酶活力：催化反应的能力，表示样品中酶 的浓度（u/ml酶液）； 总活力：整个样品中的全部酶活力，即酶活力
（u/ml酶液 ）× 酶液总体积（ ml）； 回收率：提纯前与提纯后酶的总活力之比； 比活力：单位蛋白质（蛋白质或蛋白氮）所 含有的酶活力。 提纯倍数：提纯前后比活力之比。

79 5.2.4 酶制剂的保存 温度 缓冲液 氧化/还原 蛋白质的浓度与纯度

80 5.3 酶分子改造 酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。 因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境
保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。 但是酶在实际应用中有局限性： 1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解； 2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活； 3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。

81 对策—— 酶分子工程 （MOLECULAR ENGINEERING OF THE ENZYME）
分子酶工程可以从分子水平改造酶，弥补天然酶的缺陷，并赋予它们某些新的机能和优良特性。随着各学科及相关技术的发展，特别是对酶结构与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普及，使酶分子工程已进入实用阶段。 总体来说酶的分子工程分两部分：一是分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更理想的酶蛋白；二是对天然酶分子进行改造（包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等)。

82 酶分子工程主要有以下几方面的内容 1）化学修饰（一级结构改造）：对酶分子的侧链基团、酶活性中心中的必需基团进行化学修饰，改造酶性能、研究酶结构与功能的关系； 2）变性、诱导与构象重建（高级结构调整） 3）蛋白质工程（基因水平定位突变）：用分子生物学方法克隆酶或修饰基因以便产生新的酶（如突变酶），或设计新基因合成自然界不存在的新酶（如抗体酶） 4）固定化酶：通过对酶分子内或分子间的交联，或与水不容性载体的结合制成，催化特定的反应。 5）模拟酶：用化学方法合成新的有机催化剂，使其具有酶活性。

83 5.3.1 酶分子修饰 一、酶的化学修饰 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。 化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。

84 1、修饰原理 凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），都可称为蛋白质的化学修饰。达到： 改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求） 提高酶的稳定性 扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）

85 2、化学修饰方法的几个问题 决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中： 对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等； 选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）； 选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。

86 二、变性、诱导与构象重建 （对酶高级结构调整）
二、变性、诱导与构象重建 （对酶高级结构调整） 酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理

87 实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然RNase,其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失，但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，RNase活力全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同；然而在随机情况下，8个HS—形成4个—S—S时，应有105种不同方式，但在复原过程中，走向随机的RNase肽链却只选择了其中一种方式（即与天然构象完全相同）.

88 5.3.2 酶的蛋白质工程 以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系，也是在基因水平进行蛋白质改造的技术科学。 常用：化学全合成法、限制酶酶切片断取代法等。 蛋白质工程在酶的改造方面目前研究比较系统的例子是组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂（TpA）

89 蛋白质工程的主要方法 化学全合成法 限制性内切核酸酶酶切片段取代法 寡核苷酸引物指导的定点突变

90 5.3.3生物酶的人工模拟 早在20世纪中叶，人们就已认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉，通过对生物体系结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新思想、新原理、新方法和新途径。酶是自然界经过长期进化而产生的生物催化剂，对酶这样的高效催化剂的结构功能的设计和模拟，是当今自然科学领域中的前沿课题之一。

91 模拟酶的基本概念 模拟酶又称人工酶或酶模型，它是有机化学的一个分支。由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。 一般认为，所谓模拟酶就是利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子，它们可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。 对酶的模拟已不仅局限于化学手段，化学和分子生物学方法的结合使酶模拟更加成熟起来。

92 模拟酶的分类 单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建酶活性；
机理酶模型：通过对酶作用机制如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导模型酶的设计和合成； 单纯合成的酶样化合物：化学合成具有酶样催化剂活性的简单分子； 目前，较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠酶、环番、环芳烃和卟啉等大环化合物；大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶囊酶模型等。

93 5.3.3.1抗体酶 抗体酶：通过改变抗体中与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。
可由两种途径获得抗体酶： ①采用过渡态的底物类似物诱导； ②在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。 抗体酶的制备路线包括：稳定过渡态，酸碱催化，亲核反应，邻近效应。

94 抗体酶具有典型的酶反应特性： 与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性； 具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104～108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度； 抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。

95 抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市
场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个 全新领域。利用动物免疫系统产生抗体的高度专一性，可以 得到一系列高度专一性的抗体酶，使抗体酶不断丰富。随之 出现大量针对性强、药效高的药物。立体专一性抗体酶的研 究，使生产高纯度立体专一性的药物成为现实。以某个生化 反应的过渡态类似物来诱导免疫反应，产生特定抗体酶，以 治疗某种酶先天性缺陷的遗传病。抗体酶可有选择地使病毒 外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合。抗体酶 的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程。

96 印迹酶 生物印迹是指以天然生物材料(如蛋白质、糖类)为骨架，在其上进行分子印迹而产生印迹分子具有特异性识别空腔的过程。由于天然生物材料蛋白质含有丰富的氨基酸残基侧链基团，它们与模板分子会有很好的识别作用。用这种方法制备的印迹酶就称为生物印迹酶。

97 制备生物印迹酶的过程： ①使蛋白质变性，扰乱其天然构象，使其构象柔曲更具有可塑性； ②加入模板分子，使模板分子与部分变性蛋白质充分混合； ③待模板分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联蛋白质，固定其与模板分子相结合的构象； ④经透析或其他方法除去模板分子，产生具有新的活性中心的蛋白质空穴。 模板分子通常是某种酶的抑制剂、底物类似物或过渡态类似物。

98 5.4 生物催化剂的固定化 酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。
针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。

99 5.4.1 酶的固定化方法 吸附法 包埋法 共价结合法 共价交联法

100 (一)、吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.

101 根据吸附剂的特点又分为两种： 物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、 微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机 吸附剂。 离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件 下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚 糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。

102 影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素: 1.pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。 2.离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3.蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 4.温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5.吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 6.载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

103 吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。 世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。

104 （二）、包埋法 包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。

105 1、凝胶包埋法： 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。

106 2、微囊化包埋法 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用 。
界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。

107 包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。
包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。

108 （三）、共价偶联法 是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联）。

109 共价偶联法中的几个影响因素 1、载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 2
共价偶联法中的几个影响因素 1、载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。 2. 偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。 3. 所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。 4. 要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。

110 共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，是目前应用和报道得最多的一类方法。 共价偶联法的缺点也很明显。载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。

111 （四）、交联法 共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网状结构

112 交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行胶联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。
能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2’-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。

113 共价交联法的四种形式： 酶直接交联法： 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。

114 酶辅助蛋白交联： 当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。 这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。

115 吸附交联法： 此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。

116 载体交联法： 用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。

117 四种固定化酶制备方法的特点小结 易 难 弱 强 高 中 无变化 有变化 可能 不可能 低 物理吸附 包埋法 共价交联法 共价结合法 制备
结合力 弱 强 酶活力 高 中 底物专一性 无变化 有变化 再生 可能 不可能 固定化费用 低 制法 特性

118 固定化方法与载体的选择 1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻
5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价

119 5.4.2 细胞的固定化方法 包埋法：将细胞包埋在多微孔载体内部 吸附法：利用细胞与载体之间的吸引力，将细胞固定 在载体上

120 固定化细胞的优点： 1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体 积小的生产菌集合体。 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或 连续使用。 3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。 4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。

121 5.4.3 固定化酶（细胞）的性质 有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。
 固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。  酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可以再生。  能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。

122 1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。
活力下降的原因：  酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。  固定化后的空间障碍效应的影响。  内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。  包埋法时被高分子物质半透膜包围。

123 2、固定化后酶稳定性提高 稳定性提高的原因：  固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子 伸展变形。
 酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作 用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起 作用。  抑制自降解，提高了酶稳定性。

124 3、固定化酶（细胞）的作用pH变化 酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。

125 4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。

126 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。
简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。

127 5.4.4固定化酶（细胞）的指标 相对酶活力 酶的活力回收率
固定化酶的半衰期：在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间称为固定化酶的半衰期。以t1/2表示。 固定化酶的操作稳定性是影响使用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。

128 5.5酶反应器 酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。
用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。 酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。

129 生物催化剂制备 过程调控 能量 原料 预处理 消毒 产品 产物分离提纯 生物反应器 空气 除菌 热量 酶催化反应过程示意图

130 5.5.1酶反应器的类型 按结构区分 搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）
鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR ) 填充床式反应器(packed column reactor, PCR ) 流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR) 膜反应器(Membrane Reactor, MR) 按操作方式区分 分批式反应(batch ) 连续式反应(continuous ) 流加分批式反应(feeding batch ) 混合形式 连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR） 分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）

131 5.5.1酶反应器的类型 (1)间歇式酶反应器 又称为批量反应器（Batch Reactor BSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。 优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。 缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。

132 (2) 连续式酶反应器 又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。 优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。 缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。 反应液出口 底物溶液进口

133 (3) 填充床反应器 填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。 优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。 缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。

134 (4) 流化床反应器 流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。
特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。

135 (5) 鼓泡式反应器 鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR)是利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。 鼓泡式反应器可以用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。 鼓泡式反应器的结构简单，操作容易, 剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。

136 (6) 膜反应器 膜反应器（membrane reactor, MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。 用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。 膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。

137 各种酶反应器的特点 反应器类型 适用的操作方式 适用的酶 特点 搅拌罐式反应器 分批式, 流加分批式 连续式, 游离酶 固定化酶
反应比较完全，反应条件容易调节控制。 填充床式反应器 连续式 密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。 流化床反应器 分批式 流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。

138 反应器类型 适用的操作方式 适用的酶 特点 鼓泡式反应器 分批式 流加分批式 连续式 游离酶 固定化酶 鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。 膜反应器 清洗比较困难 喷射式反应器 通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应

139 5.5.2酶反应器的设计原则 影响酶反应器设计的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑： 酶的形式(游离/固定化..) 固定化酶的形状
底物的物理性质 酶反应动力学性质 酶的稳定性 操作要求 反应器制造、控制成本

140 在应用游离酶进行催化反应时，酶与底物均溶解在反应溶液中，通过互相作用，进行催化反应。可以选用搅拌罐式反应器、膜反应器、鼓泡式反应器、喷射式反应器等。
通常颗粒状、片状、膜状或纤维状固定化酶均可采用填充床反应器（PBR），而颗粒状、粉末状及片状固定化酶均可使用于连续式搅拌罐（CSTR），膜状固定化酶要用螺旋卷膜式反应器。 可溶性底物适用于所有的反应器。难溶底物或者底物溶液呈胶体状者，易堵塞柱床，可选用FBR。颗粒状底物溶液可适用于CSTR。当反应过程需要控制温度、调节pH时，选用CSTR更为方便。 在反应器操作过程中，由于搅拌或液流的剪切作用，常会使酶从载体上脱落下来，或者由于磨损而使粒度变细，从而影响了固定化酶的操作稳定性。

141 5.5.3酶反应器的性能评价 空时：底物在反应器中停留时间 转化率：底物中有多少被转化成产物 生产强度：每小时每升反应器体积所生产的产品数

142 5.5.4 酶反应器的操作 酶反应器微生物污染的预防 酶反应器中流动方式的控制 酶反应器恒定生产能力的控制

143 5.6 生物传感器 一、生物传感器的原理 生物传感器：用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具（分析系统）。
工作原理：待测物质经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物化学反应，产生的信号继而被相应的化学或物理换能器转化为可定量和可处理的电信号，再经仪表的放大和输出，便可知待测物的浓度。

144 二、生物传感器的分类 1、酶传感器：利用酶的催化作用 2、组织传感器：利用组织中多酶系统的催化识别分子
3、微生物传感器：利用微生物的呼吸作用或酶的催化 4、免疫传感器：利用抗体与抗原之间的高特异性 5、FET生物传感器：将生物技术与晶体管工艺结合

145 5.7 酶的应用 “绿色健康，“酶”力无限 医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域

146 酶参与了生物体内所有的生命活动和生命过程
执行具体的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血酶等 清除有害物质,起保卫作用-过氧化物酶，超氧化物岐化酶等 协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换,传递与放大作用,调节生理功能-蛋白激酶 催化代谢反应,建立各种各样代谢体系与代谢途径-葡萄糖、氨基酸、核酸代谢

147 酶是生物学有力的研究工具 基因工程工具酶 基因组学 蛋白组学

148 酶和工农业生产与医学实践有着密切的关系 工业用酶：淀粉糖业 农业用酶：饲料 医疗用酶：蛋白酶 检测试剂 抗病毒等新药物开发

149 酶在医药方面的应用 用酶进行疾病的诊断 用酶进行疾病的治疗 用酶制造各种药物

150 1、通过酶活力变化进行疾病诊断 酶 疾病与酶活力变化 淀粉酶 胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降 胆碱酯酶
肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降 酸性磷酸酶 前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高 碱性磷酸酶 佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降 谷丙转氨酶/谷草转氨酶 肝病、心肌梗塞等，活力升高 γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT） 原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高 醛縮酶 急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高 胃蛋白酶 胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降 磷酸葡糖变位酶 肝炎、癌症，活力升高 乳酸脱氢酶 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常 端粒酶 癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性 山梨醇脱氢酶（SDH） 急性肝炎，活力显著提高 脂肪酶 急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高 肌酸磷酸激酶（CK） 心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高 α－羟基丁酸脱氢酶 心肌梗塞、心肌炎，活力增高 磷酸己糖异构酶 急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高 乳酸脱氢酶同工酶 心肌梗塞、恶性贫血，LDH1增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折，LDH5增高 葡萄糖氧化酶 测定血糖含量，诊断糖尿病 亮氨酸氨肽酶（LAP） 肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高

151 2、用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断 酶 测定的物质 用 途 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶
用 途 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶 尿素酶 尿素 测定血液、尿液中尿素的量， 诊断肝脏、肾脏病变 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺 测定脑脊液中谷氨酰胺的量， 诊断肝昏迷、肝硬化 胆固醇氧化酶 胆固醇 测定胆固醇含量，诊断高血脂等 DNA聚合酶 基因 通过基因扩增，基因测序， 诊断基因变异、检测癌基因

152 3、酶在疾病治疗方面的应用 酶 名 来 源 用 途 淀粉酶 胰脏、麦芽、微生物 治疗消化不良，食欲不振 蛋白酶 胰脏、胃、植物、微生物
酶 名 来 源 用 途 淀粉酶 胰脏、麦芽、微生物 治疗消化不良，食欲不振 蛋白酶 胰脏、胃、植物、微生物 治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压 脂肪酶 胰脏、微生物 纤维素酶 霉菌 溶菌酶 蛋清、细菌 治疗各种细菌性和病毒性疾病 尿激酶 人尿 治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血 链激酶 链球菌 治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折 青霉素酶 蜡状芽孢杆菌 治疗青霉素引起的变态反应 L-天冬酰胺酶 大肠杆菌 治疗白血病 超氧化物歧化酶 微生物，植物，动物 预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎 凝血酶 动物，蛇，细菌，酵母等 治疗各种出血病 胶原酶 细菌 分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡 右旋糖酐酶 微生物 预防龋齿 胆碱酯酶 治疗皮肤病，支气管炎，气喘 溶纤酶 蚯蚓 溶血栓 弹性蛋白酶 胰脏 治疗动脉硬化，降血脂 核糖核酸酶 抗感染，祛痰，治肝癌 尿酸酶 牛肾 治疗痛风

153 溶菌酶

154 栓溶酶类与心血管疾病

155 凝血酶

156 消化酶类 健美生消化酶—帮助肠胃蠕动 【产品规格】90片／瓶 【食用方法】成人每日3片，随主餐服用 【成分(每片含)】
1)消化蛋白质：木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30毫克； 2)消化脂肪：脂肪酶30毫克； 3)消化碳水化合物/淀粉：淀粉酶50毫克； 4)消化乳制品：乳糖酶30毫克； 5)消化纤维：纤维素酶15毫克。 另含：能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙，能缓解反胃薄荷叶和茴香 【适用人群】 ·消化不良者 ·肠胃疾病患者 ·大病初愈者

157 SOD

158 美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。
                                                                         美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。 1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔，1999

159 4、酶在药物制造方面的应用 酶 主要来源 用途 青霉素酰化酶 微生物 制造半合成青霉素和头孢菌素 11-β-羟化酶 霉菌 制造氢化可的松
L-酪氨酸转氨酶 细菌 制造多巴（L-二羟苯丙氨酸） β-酪氨酸酶 植物 制造多巴 α-甘露糖苷酶 链霉菌 制造高效链霉素 核苷磷酸化酶 生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷） 酰基氨基酸水解酶 生产L-氨基酸 5’-磷酸二酯酶 桔青霉等微生物 生产各种核苷酸 多核苷酸磷酸化酶 生产聚肌胞，聚肌苷酸 无色杆菌蛋白酶 由猪胰岛素（Ala-30）转变为人胰岛素（Thr-30） 核糖核酸酶 生产核苷酸 蛋白酶 动物、植物、微生物 β-葡萄糖苷酶 黑曲霉等微生物 生产人参皂甙-Rh2

160 青霉素酰化酶与抗生素改造