免疫学实验课件 生化与免疫学实验室.

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1 免疫学实验课件 生化与免疫学实验室

2 中性粒细胞的吞噬作用 【实验目的】 　　1.熟悉中性粒细胞吞噬实验的原理和方法。 　　2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

3 【实验原理】 　　中性粒细胞具有吞噬杀菌功能，当与颗粒性物质（如葡萄球菌等）混合孵育一定时间后，颗粒性物质被吞噬杀灭，根据吞噬率、吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。

4 【实验材料】 　　1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（浓度6~10亿/ml)。 　　2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇，碱性美蓝（或瑞氏）染液。 　　3.血红蛋白吸管，凹玻片，载玻片，采血针，微量加样器，湿盒，显微镜，恒温培养箱，75%酒精，棉签，香柏油，二甲苯等。

5 【实验方法】 　　1、用微量加样器，吸取肝素20ul加入洁净凹玻片凹孔内。 　　2、用酒精棉签消毒手指后，刺破皮肤，以血红蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔内，并充分混匀。 　　3、用微量加样器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔内，充分混匀。 　　4、将凹玻片置于湿盒内，30℃温箱中30min，其间每隔10min摇匀一次。 　　5、取一小滴上述混合液，置于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片，待干。 　　6、滴加甲醇固定3min，水洗。 　　7、加碱性美蓝染色1~2min，水洗，印干。 　　8、置油镜下观察吞噬和未吞噬的白细胞并计数。

6 【实验结果】

7 【实验思考】 　　1、在吞噬细胞中发现细菌时，如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬细胞表面的细菌？ 　　2、简述机体非特异性免疫的概念及特点。

8 凝集反应 【实验目的】 　　1．了解凝集反应的原理、基本类型及其临床意义。 　　2．掌握玻片凝集实验、间接凝集实验的实验方法和结果分析。

9 【概述】 　　在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。凝集反应是一种定性的检测方法，也可以进行半定量检测。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应。由于凝集反应方法简便，目前在临床检验中仍被广泛应用。

10 一、直接凝集反应 　　细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应 。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。 玻片凝集试验——ABO血型鉴定 　　玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒抗原，如菌液或红细胞抗原各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性。此法简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血型的鉴定。

11 【实验原理】 　　人类ABO血型抗原主要有A和B两种，根据红细胞表面这两种抗原的有无可把血型分为四种。据此，将抗A和抗B抗体分别与待测红细胞混合，抗A或（和）抗B抗体与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。 　　　　　　ABO血型的划分 红细胞表面Ag 血清中Ab A型 A 抗B B型 B 抗A AB型 A、B —、— O型 抗A、抗B

12 【实验材料】 　　1．ABO血型鉴定试剂盒　内含抗A分型试剂和抗B分型试剂各1支。 　　2．一次性采血针1枚、洁净玻片2块、75％酒精、灭菌棉签。 　　3．84消毒液

13 4．观察红细胞有无凝集发生。如有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散。判定结果后把玻片放入消毒液中。
【实验方法】 　　1．取洁净载玻片1块，并标记（如图） 2．将抗A、B分型试剂分别加 1滴于标记有A、B的玻片两侧。 A B 抗A 抗B 3．用酒精棉签消毒被检者手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出。用另一载玻片一端取适量血液加入抗抗A分型试剂，并混匀；用另一端再取适量血液加入抗抗B分型试剂，并混匀。用干棉签止血。 　　4．观察红细胞有无凝集发生。如有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散。判定结果后把玻片放入消毒液中。

14 记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检者的血型。
【实验结果】 　　记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血型鉴定表(下表)，判断受检者的血型。 　　　ABO血型鉴定表 抗A分型试剂侧 抗B分型试剂侧 血型 + — A B AB O “＋”表示红细胞凝集，“－”表示红细胞未凝集

15 二、间接凝集反应 　　将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 　　根据载体的不同可将间接凝集反应分为：间接血细胞凝集试验、间接乳胶凝集试验（及间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄球菌协同凝集试验等。

16 间接凝集抑制试验——妊娠试验 【实验原理】
　　可溶性抗原致敏的乳胶颗粒与相应抗体作用可使乳胶颗粒凝集，此为间接乳胶凝集试验。若使抗体先与可溶性抗原作用，再加入该抗原致敏的乳胶颗粒，则乳胶凝集被抑制，此为间接乳胶凝集抑制试验。 　　孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。HCG与抗HCG抗体先作用后，再加入HCG致敏的乳胶颗粒，不出现凝集反应，此为妊娠试验阳性；非孕妇尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗体，抗体与后加入的HCG致敏乳胶结合呈现凝集现象，则妊娠试验阴性。

17 【实验材料】 　　1．妊娠诊断试剂盒：内含抗血清（抗HCG）、乳胶抗原（HCG致敏） 　各一支 　　2．待检尿、孕妇尿、正常尿。 　　3．有格玻片和毛细吸管等。

18 【实验方法】 　　1．在玻片的第1、第2和第3格内分别加1滴正常尿、待检尿及孕妇尿。 　　2．每格内加入妊娠诊断试剂抗血清1滴。轻轻摇动1~2 min使其充分混匀。 　　3．每格加入乳胶抗原1滴，轻轻摇动玻片3~5 min后观察结果，记录各标本有无凝集现象。

19 【实验结果】 　　孕妇尿格呈均匀浑浊乳状液，无凝集，妊娠试验阳性；正常尿格出现白色细小凝集物，随时间延长凝集物变成小块状，妊娠试验阴性。待检尿若为乳状液，妊娠试验阳性；若出现凝集，则妊娠试验阴性。

20 【注意事项】 　　1．试验所用诊断试剂用前应充分摇匀，而且应在有效期内使用。 　　2．加样用的滴管及混匀用的牙签不能共用。 　　3．加样不宜太多，玻片应始终保持水平，以防两格之反应液相混。

21 【实验思考】 　　1．记录血型鉴定试验、乳胶妊娠诊断试验的材料、方法及结果判定（可用图示或表格方式表示）。 　　2．直接凝集试验与间接凝集试验有何不同？ 　　3．在各凝集试验中都设有相应对照，有何意义？若对照出现异常如何分析及解决？

22 沉 淀 反 应 【实验目的】 1．掌握对流免疫电泳的基本原理、方法。 2．熟悉琼脂单向扩散，双向扩散的基本原理、方法、结果分析及临床用途。
3．了解火箭免疫电泳的基本原理、方法。

23 【概述】 可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当两者比例合适、并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反应。 沉淀反应是临床上最常用、最基本的方法之一。它的种类较多，可分为琼脂扩散试验、免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等。

24 一、琼脂扩散试验 利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当两者比例合适时，就出现白色沉淀线，为阳性反应。本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。 琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。 (一)单向琼脂扩散试验 (示教) (二)双向琼脂扩散实验 (示教)

25 二、对流免疫电泳 【实验原理】 带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。多数蛋白质抗原在碱性缓冲液中带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体属球蛋白，在碱性缓冲液只带微弱的负电荷，而且相对分子质量较大，电泳力较小，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。这样就使抗原和抗体定向对流，在两孔间相遇时发生反应，并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。这种将双向琼脂扩散和电泳技术结合在一起的方法称为对流免疫电泳 。

26 【实验材料】 1．电泳缓冲液：pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲液。 2．抗体：抗AFP。 3．抗原：AFP阳性血清、待检病人血清。 4．1％琼脂 用pH 8.6巴比妥-盐酸缓冲液配制，冰箱保存备用。 5．电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔器、10 ml吸管、移液器、移液头。

27 3．加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的小孔中，抗体加入另一侧小孔中，以加满为度，不可溢出孔外。(如图示)
【实验方法】 1．制板 2．打孔 3．加样 将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的小孔中，抗体加入另一侧小孔中，以加满为度，不可溢出孔外。(如图示) 4．电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上，抗原侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。搭好桥后，接通电源，控制电压6～10 V/cm板长，电泳约30～60 min。 5．关闭电源，取出琼脂板，观察结果。 Ag Ab 标记孔 沉淀线

28 【实验结果】 将玻片对着强光源，先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性，否则AFP试验为阴性。

29 【注意事项】 1．电泳时电流不宜过大，以免蛋白变性。 2．抗原和抗体的电极方向不能搞错。 3．抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。 4．电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。

30 【实验思考】 1．单向扩散与火箭电泳、双向扩散与对流免疫电流比较各有何特点？ 2．对流免疫电泳中，抗原为何放阴极端，抗体为何放阳极端？

31 外周血单个核细胞的分离 【实验目的】 1．熟悉免疫细胞分离的常用方法。 2．掌握外周血单个核细胞分离方法的原理、操作规程。

32 【实验原理】 人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075～1.090之间而近于等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。从而分离出PBMC。

33 【实验材料】 1．肝素溶液 用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4 ℃下保存备用。 2．淋巴细胞分层液 市售或自配，20 ℃时密度应为(1.077±0.001) g/L。 3．Hanks平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2～7.4。 4．完全RPMI-1640培养液。 5．15 ml或50 ml锥底离心管。 6．水平离心机，显微镜。 7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。 8．2％台盼蓝染液。

34 【实验方法】 1．采集静脉血若干毫升（随需要而定），注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝。 2．用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS，使血液等倍稀释。（此步骤亦可省去） 3．吸取淋巴细胞分层液（每10 ml稀释血加5 m1分层液）置于15 m1或50 m1离心管中，然后将离心管倾斜45°角，将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面。应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。

35 4．将离心管置水平式离心机内，在18～20 ℃下，以2000 r/min离心30 min，离心后，管内分层如下图所示

36 5．用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。
6．将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-l640洗涤2次，依次以2 000 r/min，1500 r/min在室温（18～25℃）下离心10 min，弃上清。 7．用完全RPMI-1640定容细胞，计数细胞后再调整细胞至所需浓度。 8．用台盼蓝染液检查所分离细胞的活性：取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液，5～10 min后取样作湿片高倍镜检。

37 【实验结果】 台盼蓝染液检查活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，一般活性应在95％以上。

38 【注意事项】 1．与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性传染病传染。 2．操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。 3．细胞分层液在室温下应为(l.077±0.001) g/L；应避光4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。 4．稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。

39 免疫系统组分的分离及活性检测 【实验目的】 1．掌握免疫系统组分中胸腺、脾组织结构及淋巴细胞的功能。 2．熟悉淋巴细胞分离方法。
3．建立对免疫学的整体概念，加深对免疫系统组成和功能及重要性的理解，提高学习兴趣及主动性。 4．培养学生在实际工作中动手、动脑、观察和分析与解决问题的能力。

40 一、小鼠胸腺、脾摘除术 【实验原理】 小鼠的胸腺和脾是研究T细胞和B细胞特性与功能最主要的材料来源。观察其组织结构、细胞数目及活性等，可进一步了解该机体的免疫状况。是目前探讨免疫学理论及与其有关疾病的最好模型之一。故摘除胸腺和脾是进行研究的前提。

41 【实验材料】 1．昆明种小鼠20～24 g。 2．75%酒精、无菌棉签。 3．小手术台、大头针、眼科镊子、剪子。

42 【实验方法】 1．取小鼠一只以眼球采血（抗凝备用）处死。 2．小鼠用大头针固定在小手术台上，位置摆正。 3．用75%的酒精消毒小鼠皮肤。 4．打开腹腔及分离胸骨后软组织。 5．用眼科剪从腹部向上沿正中线剪开胸骨到颈部。 6．暴露胸腺后轻轻剥离两叶胸腺。 7．在上腹部剥离脾，剪除结缔组织被膜。

43 【实验结果】 观察胸腺、脾组织结构及其是否完整。有时间可在电子天秤称重。 【注意事项】 1．剥离胸腺时要特别小心，以保证两叶完整性。 2．剥离胸腺、脾时要完全去掉其他组织。

44 二、小鼠淋巴细胞分离及活性检测 实验原理、材料、方法及结果略，与前述外周血单个核细胞分离基本相同，不同之处： 1．小鼠淋巴细胞的密度为1.098 g/ml，故分层液的密度不同。 2．取胸腺、脾经200目钢丝网过筛的细胞悬液，用分离层液分离淋巴细胞。 3．取眼球血液用分层分离淋巴细胞。

45 【实验思考】 1．为什么取胸腺和脾制备淋巴细胞，可了解机体的免疫功能？ 2．如何理解机体免疫系统各组成部分功能正常的重要性？　 3．分离淋巴细胞的意义何在？ 4．为进一步了解机体免疫功能还需进行哪些检测？

46 免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。 目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），它是将可溶性抗原（或抗体）吸附于固相载体上，加入酶标抗体（或抗原）与吸附在载体上的抗原（或抗体）结合，形成酶标记复合物，再加入酶底物时，即可显色。颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量相关。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），相应的底物分别是邻苯二胺（OPD）和对硝基苯磷酸盐。实验方法有间接法、夹心法和竞争法 。

47 一、 ELISA夹心法检测HBsAg 【实验目的】 1．熟悉ELISA的原理、夹心法。 2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】
　　2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】 　　采用多克隆抗-HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗-HBs-HRP，如待测标本中含有HBsAg时就与包被抗-HBs、抗-HBs-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之就无显色反应。

48 【实验材料】 　　1．乙肝病毒HBsAg酶联免疫诊断试剂盒（由厂商供应）。 　　预包被微孔条（用纯化的抗-HBs包被）。 　　酶联试剂（用HRP标记的抗HBs）。 　　HBsAg阳性对照。 　　HBsAg阴性对照。 　　洗涤液(浓缩液)。 　　显色剂A、B。 　　终止液（2 mol/L H2SO4）。 　　2．微量加样器，混合振荡器，酶标测定仪，恒温箱，吸水纸，蒸馏水等。

49 【实验方法】 　　1．配液 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释使用。 　　2．编号 将微孔条固定于支架，按序编号。 　　3．加样 分别用加样器加待检血清和阴、阳性对照50 μ1（1滴）于相应孔中，设空白对照孔（加50 μ1洗涤液）。 　　4．加酶 除空白对照外，每孔加酶联试剂50 μl（1滴）。 　　5．温育 振荡混匀，置37℃ 30 min后取出。 　　6．洗涤 甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置2 s，甩干，重复5次后拍干。 　　7．显色 每孔加显色剂A、B各50 μl（1滴）振荡混匀，37℃暗置15 min。

50 【实验结果】 　　1．目测 在白色背景下观察各孔显色情况，有明显蓝色者为阳性，无色者为阴性。 　　2．酶标仪检测 每孔加终止液50 μl（1滴）混匀，用酶标仪450 nm波长测各孔A值。 计算P/N值： 　　结果判断：P/N值≥2.1者为阳性，＜2.1者判为阴性（阴性对照孔A值小于0.05时以0.05计）。

51 【注意事项】 　　1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。 　　2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。 　　3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。 　　4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 　　5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。

52 ELISA竞争法检测抗-HBc 【实验目的】 1．熟悉ELISA的原理、方法。 2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】
　　2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】 　　采用基因工程重组HBcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗-HBc含量高，则抗-HBc-HRP与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。 ELISA

53 【实验材料】 　　1．乙肝病毒核心抗体酶联免疫诊断试剂盒。 　　（1）预包被微孔条（预包被纯化乙肝核心抗原）。 　　（2）酶联试剂（用HRP标记特异性乙肝核心抗体）。 　　（3）抗-HBc阳性对照。（4）抗-HBc阴性对照。 　　（5）洗涤液（浓缩液）。 　　（6）显色剂A、B。 　　（7）终止液（2 mol/L H2SO4）。 　　2．微量加样器，振荡器，酶标仪，恒温箱，吸水纸，蒸馏水，生理盐水等。

54 【实验方法】 　　1．配液 浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释使用。 　　2．样品稀释 将待测血清样品用生理盐水1:30稀释后检测。 　　3．编号 将微孔条固定于支架，按序编号。 　　4．加样 分别用加样器加已稀释的待检血清和阴、阳性对照100 μl（2滴）于相应孔中，设空白对照（加50 μl洗涤液）。 　　5．加酶 除空白对照外，每孔加酶联试剂50 μl（1滴）。 　　6．温育 振荡混匀，置37℃ 30 min后取出。 　　7．洗涤 甩去孔内液体，扣干，用洗涤液注满各孔，静置5 s，甩干，重复5次后拍干。 　　8．显色 每孔加显色剂A、B各50 μl（1滴），混匀，37℃温育15 min。

55 【实验结果】 　　1．目测 在白色背景下观察各孔显色情况，无色或显色强度与阳性对照相近者，判为抗-HBc阳性，显色强度接近或深于阴性对照孔者，判为抗-HBc阴性。 　　2．酶标仪检测 每孔加终止液50 μl（1滴），混匀，用酶标仪（450 nm波长）测定各孔A值。 计算P/N值： 　　结果判断：P/N≤0.5者判为抗-HBc阳性，P/N＞0.5者判为抗-HBc阴性。

56 【注意事项】 　　同HBsAg法定的注意事项。 【实验思考】 　　1．竞争法能用于检测一般的抗原吗？ 　　2．待测标本显色强度愈深是否意味着抗体浓度愈高？