实用HPLC方法的建立 华东理工大学分析测试中心 施超欧 2003.03.30.

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1 实用HPLC方法的建立 华东理工大学分析测试中心 施超欧

2 目录 1 前言 2 HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 2.2 明确分析目的 2.3 样品的预处理与检测
1 前言 2 HPLC方法建立的步骤 2.1 了解样品的有关情况 2.2 明确分析目的 2.3 样品的预处理与检测 2.4 HPLC分析模式的选择 2.5 色谱条件 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理 2.7 定性和定量方法的建立及论证

3 3 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.2 检测器的选择 3.3 样品的溶解及预处理 3.4 样品的进样量 3.5色谱柱的选择及保护与再生 3.6 泵的选择 3.7 色谱工作站 4 分析方法建立的实例 4.1 等度分析 4.2 梯度方法的建立 4.3 色谱柱及pH的影响

4 5 色谱分析中各种图谱现象的判断 5.1 基线噪音的产生和处理 5.2 基线漂移(上漂和下漂) 5.3 倒峰的产生和消除 5.4 鬼峰的产生和消除 5.5 峰前移和退后的判断 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断 5.7色谱双峰的判断 5.8 色谱峰变胖的判断和处理

5 1 前言 HPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。
1 前言 HPLC作为色谱的一个重要分支，在色谱分析中占有重要的地位，将逐步取代气相色谱成为最重要的色谱分析手段。 HPLC技术的发展和科技的进步，使得HPLC广泛应用到各个领域。 HPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。 HPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。 出的来，跑的快，分的开

6 2 HPLC方法建立的步骤

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8 2.1 了解样品的有关情况 首先应对样品有足够的了解，并明确分析目的（同一样品，不同的测试要求，其方法也可能不一致）。 样品的重要性质包括：
所含化合物的数目； 化学结构（官能团）； 分子量； pKa值； UV光谱图； 被测组分在样品中的浓度范围； 样品的溶解度、沸点及其稳定性； 可能存在的干扰物质及样品的复杂程度等。

9 1 分析大分子、小分子还是生物分子 一般常规的HPLC分析分子量2000以下，大分子一般采用凝胶色谱、生物大分子采用不能变性的色谱体系。 2 样品是混合物、天然物质还是基本是单一物质。 如果是天然物质，一般分离完全采用梯度体系。混合物中是否有结构类似的异构体，组分复杂的还是采用梯度，是否是系列反应的产物。 3 测定是主成分、还是少量成分或痕量成分。 主含量的测定一般比较容易；但少量要考虑分离完全的问题；痕量成分则要考虑检测器的类型，采用何种提取方法和检测的灵敏度等。

10 4 分离化合物是极性，弱极性、非极性还是离子化合物、两性化合物。
非极性化合物以正相体系较多，如果溶于反相体系的溶剂，可采用反相体系。 弱极性、极性化合物采用反相较为方便，可在流动相中添加改性剂，调节合适的pH。 离子化合物可以采用反相，调节pH；或者添加离子对试剂；也可采用离子交换。 两性化合物中水溶性差的可采用反相；但在反相出峰快的则考虑离子交换；也可考虑衍生后测定。 对于极性的糖类物质，可用NH2柱，有条件的用聚合物的糖柱。多糖类的则要采用凝胶系统。 大分子的极性化合物、离子化合物，往往采用特定的色谱柱，多为聚合物柱子。 手性化合物，则要用手性流动性或者采用手性柱。

11 5 样品的溶解度、沸点 样品在不同溶剂中的溶解度，对色谱条件的选择非常重要，测定其溶解的性能，则可以判断其化合物可能的类型。 非极性样品不溶于水，但溶于有机溶剂。如果只能溶于非极性溶剂，一般建议做正相。溶于极性溶剂，以反相为上策。 极性和离子化合物一般都溶于水，但在不同pH下区别可能很大。 极性化合物在水和极性溶剂中都有一定的溶解度。 从溶解度可以判断出采用何种体系为佳。 易挥发性的低沸点的物质在ELSD中难以检测。 有存在特例。

12 6 样品的稳定性 如果样品存在水解、光解、醇解、氧化、分解则测定时需注意。 对光敏感物质，用棕色瓶，避光保存，不宜存放，随配随做。 易水解的物质、要选择合适的溶解溶剂。 有些样品可能存在醇解，流动相不能用甲醇，而要用乙腈。 易氧化的物质，溶解时可考虑加抗氧剂，调节pH，如PAP的测定。胺类化合物。 产品不稳定的化合物，分析越快越好。

13 7 化合物的化学结构（官能团） 常见的基本结构是苯环、杂环、多环芳烃。基团有COOH、OH、NH2、SO3H、Cl（Br）、CHO、CO、CH3、C2H5、N=NH、SO、SO2、-O-等。 亲水性的基团在反相中出峰时间前移，疏水性的基团出峰后移。 从存在的结构可以判断出其在溶剂中的溶解度。 8 化合物的pK 值 知道pK值，有助于方法的建立，尤其流动相pH的选择。 pK的差异是官能团造成的。

14 9 UV光谱图 知道其吸收波长的曲线有助于检测，如果有DAD则关系不大。多组分的样品，宜多选几个波长。 同一样品在不同的流动相及pH最大波长可能不一致。 有双键共轭的结构紫外吸收较大，单键的则在低紫外区有一定的吸收 10 样品的复杂层度 梯度方法分析 预处理,分成几个部分分析 痕量物质的富集 总之，充分了解了被分离样品的性质，将可能提供一个参考的分析条件，缩短分析时间和分析难度。

15 2.2 明确分析目的 1 定量分析？检出某种物质？未知物的确定？纯化制备？光谱鉴定？ 2 是否将所有组分分开，定性？一种条件有困难？分组分析？ 3 定量分析的准确度和精密度？（主成分在1～2％） 4 不同样品基质对分离的影响（如原料药、粗品、精品、残留、环境样品等） 5 分析的工作量，少数还是大量？时间和效率与分离的选择。 6 实验室的条件，如HPLC仪器的配置和档次；色谱柱系统；是否有恒温；是否可以做梯度；分析成本；实验室人员的操作技能；方法的移植等等。

16 2.3 样品的预处理与检测 样品来源的形式 1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配） 2 需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作 3 固体样品－选择合适的溶剂 4 需提取分离的样品 5 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。 总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。

17 2.4 HPLC分析模式 按照样品的特性分为以下二类： A 一般样品（<2000DW） 可采用基本标准的方法。 （中性的、离子的）－反相、离子对、非水反相、正相、离子交换。 B 特殊样品 无机离子、异构体、对映体、生物样品、肽类、核苷酸、大分子、蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。

18 2.5 色谱条件 色谱条件主要包括以下几个方面： 流动相的组成及流速、温度等。 色谱柱的类型 样品处理方法 检测器的确定和参数 数据处理
方法的稳定性及其它

19 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理 优化包括合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性， 对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。 建立合理的数据处理方法等。

20 2.7 定性和定量方法的建立及论证 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。

21 3 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.1.1 流动相的试剂类型 以常见的HPLC为例，正相、反向、离子对。
3.1 流动相的选择 3.1.1 流动相的试剂类型 以常见的HPLC为例，正相、反向、离子对。 正相的试剂有正己烷、环已烷、正庚烷、戊烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六圜，也可加一些极性试剂如乙酸、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等 注意：这些有机试剂的纯度非常重要，一是含水的问题，（水的含量将影响保留时间，重复性差）二是其中芳香环杂质对紫外检测的干扰，国产分析纯的试剂一般质量很差，不能直接用于低波长的紫外检测，需重新处理（用硅胶柱过滤其杂质）。最好采用色谱纯的试剂，但成本很高。

22 离子对试剂 对强碱性和酸性的离子化合物，除了采用离子交换色谱外，也可在流动相中添加离子对试剂，用C18柱进行分离。 离子对试剂可分为二大类酸性和碱性 分离多羧基、磺酸基的化合物一般添加长链的胺盐，如四丁基氢氧化胺、四丁基溴化胺、四丁基氯化胺等。 还可以添加Na2SO4等无机盐，调节合适的pH。 分离碱性的胺类化合物，一般添加八烷基磺酸钠，十二烷基磺酸钠等。

23 反相色谱试剂 有机试剂最主要的是甲醇、乙腈、其他的有四氢呋喃、异丙醇，乙醇、二氧六圜很少见到。 甲醇优质的分析醇基本可以满足分析，乙腈必须是色谱纯（示差、蒸发光散射？可以用分析纯），四氢呋喃应用新的，建议为色谱纯，也可以自己蒸馏处理。分析纯的THF少量的添加在高波长勉强可以。 水理论上要求超纯水，但在实际中，我们认为HPLC－MS（飞行时间质谱）和HPLC－ELSD必须用超纯水。其它的用纯水和蒸馏水及类似水质也可以，用优质的桶装蒸馏水、纯水是能满足分析要求的。去离子水勉强可以，不能在低波长下使用。

24 酸，可添加一定量的无机酸和有机酸。 无机酸有H3PO4、H2SO4、HClO4，HCl中Cl对不不锈钢管路有腐蚀作用，HNO3有氧化性很少见到。一般浓度在0.1%，pH在2－3之间。 有机酸有甲酸、乙酸、三氟醋酸、柠檬酸等。 弱酸浓度在0.5－10％。三氟乙酸是强酸用量同无机酸。 加酸的作用一是在低pH 下，抑制被弱酸性物质的电离；延长保留时间抑制拖尾。二是调节流动相的pH，起到缓冲作用。 注意：流动相的pH一般不能低于2，否则将缩短色谱柱的寿命。

25 无机盐和有机盐 种类很多，常用的是钾盐和钠盐。磷酸盐、硫酸盐醋酸盐。 Na2HPO4,NaH2PO4,K2HPO4,KH2PO4,Na2SO4,NaAC,柠檬酸钠，EDTA钠。 胺类试剂 三乙胺、二乙胺、NH4OH等， 类似离子对的作用，在C18中，并能抑制峰的拖尾。其次调节流动相的pH。 流动相的选择原则是，非极性的一般有机溶剂和水能解决。极性样品，要添加改性剂，并控制pH值。离子样品，C18柱用离子对试剂，也可控制pH值来处理，或者用离子交换树脂。

26 3.1.2 流动相的平衡 甲醇水系统一般比较容易，30分钟内完全可以，短柱时间比较快。 如果流动相添加离子对试剂，在实际操作中，建议先用一定比例的水平衡，15分钟以上，再换成加离子对试剂的流动相，开始有机相比例可以低些，初步平衡后，调到合适的浓度。 如果加酸，相对平衡时间比较快，直接上一般问题不大。 如果是改性剂，pH缓冲液，平衡时间取决于缓冲液的浓度和pH值，先用水平衡一段时间，再换上缓冲液，浓度低的和pH近中性的时间就比较长，浓度大的时间相对短些。盐的浓度一般在0.01~0.05M之间，过高的盐浓度，在有机相高、温度低时易析出，杜塞柱子。 分析完后，先用含水流动相洗去无机盐，再用有机溶剂。

27 3.2 检测器的选择 目前HPLC的检测器有UV、DAD、ELSD、RI、FS、PAD、ED、MS（APCI、ESI）。
紫外检测器有单波长和多波长之分，最低可到190nm，高可达900nm， 多波长检测器可同时选定几个波长测定 注意不同物质其紫外吸收曲线不一，灵敏度差异极大，同一物质不同的流动相吸收曲线也不一致。

28 紫外检测器是使用最多的一种，关键是波长的选择。其一般的规律如下：
如果分子足够大，在紫外区总有一定的吸收。对于小分子，小于2000，从分子结构中可以判断其最大的吸收波长，也可计算得到。 典型的含苯结构的化合物在254nm，具有共轭结构。一般有几个环，就有几个吸收峰。如果存在对称结构，最大波长往往在230nm以下。 嘧啶环，杂环类似苯环结构。 含COOH、C=S、C=C都有红移现象，如果共轭则更明显。，一般选择210－230nm。 染料其最大波长在可见光区，低紫外吸收反而小，一般从颜色可以判断出。

29 DAD－二极管阵列检测器（512，1024）其特点是能进行光谱扫描，能得到三维的色谱图。
其作用除了紫外的功能外（灵敏度低于紫外），并能得到分离物质的紫外光谱图，对被分离物质光谱图的比较鉴别峰的纯度，有一定的选择性。 其最大的优点是，在分析时，可避免因波长选择的关系，漏掉了一些色谱峰，得到未知物的最大吸收波长。 但检测器的价格比UV高。

30 示差检测器 质量型检测器，主要用于非紫外吸收的物质的检测，如糖、酯类等。 灵敏度比紫外低一个数量级，对所有物质响应。对温度敏感，仪器平衡时间长，不能梯度分析。

31 ELSD检测器是90年代后期才普及的一种质量型检测器，主要是替代RI检测器，其优点是对所有不挥发性的物质有相应，同其质量有关，往往呈非线性关系。可进行梯度分析，对不挥发的、紫外吸收很小的物质效果尤其好。 但其缺点是，挥发性的物质损失而检测不到、极易氧化的物质变质。流动相要求高，不能含有不挥发的盐类，因此流动相有较大的限制。 ELSD目前主要有Alltech 2000（500），PL1000，DDL31 和SEDEX55，65，75等，有分流和不分流二大类。

32 荧光检测器 荧光检测器是一种专属性检测器，有荧光的物质响应，灵敏度度高，一般多用于多环芳烃的分析。其主要参数是激发波长和发射波长，发射波长大于激发波长，其激发波长的确定可通过紫外扫描得到。 电化学检测器 可分为直流安培、脉冲安培和电导，安培用于电活性物质的检测，电导用于测定离子。

33 质谱检测器 HPLC中的质谱检测器同GC中不同，主要有APCI和ESI二种，每种有正离子和负离子二种模式。正离子一般以加Na、加钾或加氢方式出现。 其它类型的检测器

34 3.3 样品的溶解及预处理 样品的类型前面已经提到，并作了分类。对于复杂的样品，根据分析的要求和对象，必须有合理的提取方法，溶剂萃取、索氏提取、过层析柱、超声萃取、皂化、衍生等，这里不一一谈了。 对于直接可以溶解进样的样品，这里需要注意以下几点： 被测样品的成分必须全部溶解，除非特意处理。 样品溶解的原则是相似相溶，首选流动相，如直接不行，或溶解度低，可先用其他溶剂溶解，再用流动相稀释。 在特殊的情况下，可用流动相相互溶的溶剂溶解样品，并进样，但注意二者极性的差异。否则将得到错误的分析结果。 易氧化分解的物质,配后立即分析。

35 3.4 样品的进样量 如果是含量的定量分析，有自动进样器最好，手动进样的操作要求高，生手往往做的精度差。要达到足够的精度，进样量为定量管的4倍体积以上，快速转动后停留一段时间，，注意排液管的方向。如果样品溶剂与流动相不一致，极性大时，进样体积不要太大，极易出双峰和前沿峰。 面积归一化法，建议进样量不要太大，尤其在低波长分析时，防止溶剂进样峰的的干扰，尤其样品溶剂与流动相相差很大时，进样体积必须很小。

36 3.5色谱柱的选择及保护与再生 3.51 色谱柱的选择 首选C18，或C8，以15cm为佳，可解决80％的样品分析，柱效应大于50000。如有条件采用进口色谱柱。特殊样品用特定的柱子。 不同柱子其保留性差异很大，相同条件，不同柱子比例会不一样。 碱性化合物用BDS柱，糖用NH2柱。 不同色谱柱，其合适的pH范围不一，一般在 之间，有的色谱柱比较耐碱，kromasil可以到10，而杂化 xterra 在1－12, XDB在 pH 3-11 。 一体化的柱子也比较耐碱。 现在新型色谱柱不断出现，虽是C18类型，但差异会很大。

37 3.52 色谱柱的保护、平衡和保存 纯样品分析不加保护柱也许可以，复杂和天然样品必须加上保护柱（有各种类型），延长分析柱的寿命。 色谱柱的平衡在流动相中已经提到了，注意流动相的pH值，过低和过高将损伤柱子。当有机相比例很高时，盐浓度不能太高，否则温度低的话，盐析出将引起柱子和管路的杜塞，压力大增。 含盐的流动相在分析完后，应用水洗去盐，再换成有机溶剂。 色谱柱的保存，参照说明书，反相柱一般在甲醇或乙腈中。

38 3.53 色谱柱的清洗 用比你的流动相更强的溶剂冲洗 为了增加强度选择反相溶剂 对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗 没有缓冲盐的流动相 100% Methanol 甲醇 100% Acetonitrile 乙腈 75% Acetonitrile :25% Isopropanol 75乙腈 ：25％异丙醇 100% Isopropanol 异丙醇 100% Methylene Chloride★ 二氯甲烷 100% Hexane ★ 已烷 当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相

39 3.54 色谱柱的维修-物理阻塞 在安装之前前后测试压力差 如果柱压太高,反装色谱柱,并用10-20倍体积的流动相冲洗色谱柱,监测压力变化. 若出现沉淀,(如:蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1%TFA／80％乙腈，6M盐酸胍、THF等） 若还无效，更换过滤片

40 3.55 色谱柱修复和再生 --化学变化-I 由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的。
由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复。 梯度洗脱的方式 (水 -> 强有机溶剂) 通常最有效。 低 pH 流动相, 如 0.1% TFA or 0.01M H3PO4, 也是有效的。 升高温度（60-80℃）

41 色谱柱的修复和再生 --化学变化 –II Example: 4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18 Flow rate: 1 mL / min; Temp: ~80℃ A: 0.1% TFA in water B: 0.1% TFA in acetonitrile 100% A for 30 min.; % B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return to 100% A in 5 min. Repeat 3 times。 6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积。 XDB, 有机聚合物等填料可使用高pH 水溶液 /有机溶液，如： 0.01M NaOH 50% 异丙醇 /水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间 (15-30 min)。

42 3.56 色谱柱使用的几个注意点使用保护柱 样品和流动相过滤 柱子反做(当正做实在不行时) 当柱压明显升高时，对柱头塞板清洗及更换部分填料。 少使用离子对试剂 色谱柱避免强酸强碱接触，选择合适保存条件。 分析时，避免长时间色谱柱进大量气泡，长时间不用，经常保存流动相过，防止柱子干掉。

43 3.6 泵的选择 泵可分为单泵、双泵和四元泵。方法建立建议用双泵或四元泵。 泵也可分为高压混合和低压混合。四元泵是低压混合。
高压混合不易出气泡，低压混合应严格脱气，最好用在线脱气机。 为避免气泡产生，可在柱后接反压柱。 分析完后，避免盐类在管路中过夜。 泵的运行压力建议不超过极限值的50－60％。

44 3.7 色谱工作站 如有可能，建议采用原装色谱工作站。有的单位因经费紧张，采用国产工作站，这也可以的。
国内工作站种类很多，但技术支持都比较弱。 研究、方法开发的单位还是采用原装工作站比较好，并注意及时升级。

45 4 分析方法建立的实例 样品： 4.1 等度分析 色谱柱：C18，4mm×30mm
4.1 等度分析 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

46 改变容量因子 K'

47 改变选择性∶a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱

48 4.2 梯度方法的建立 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生
定量分析的重复性较低 分析时间长

49 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度

50 梯度洗脱的可变参数 A及B(可能还有C和D液)的成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状

51 如不用梯度：分离不理想

52 梯度条件的优化

53 梯度曲线的变化∶凹线

54 梯度曲线的变化∶凸线

55 梯度平衡时间的影响（一） 10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复

56 梯度平衡时间的影响（二） 平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。

57 有机污染物的影响（一） 50ml超纯水的有机物污染状态

58 有机污染物的影响（二） “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析

59 有机污染物的影响（三） 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析

60 梯度方法开发实例 - 第一步 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好

61 梯度方法开发实例 - 第二步 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。

62 梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。

63 梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。

64 梯度方法开发实例 - 第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。

65 梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。

66 梯度方法开发实例 - 第七步 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。

67 4.3 色谱柱及pH的影响 3-丁基吡啶 4-苯基丁胺 尿嘧啶 4-苯基丁酸 苯酚 丙基苯 1,4-二羟基蒽醌 N,N-二乙基间甲苯酰胺
丁基苯 * 4-Phenylbutylamine was not used for testing at pH 2.5 ** 4-Phenylbutyric acid was not used for testing at pH 7

68 苯基[a]芘 1,2:3,4:5,6:7,8 -四苯基萘 菲[3,4-c]并菲

69 HPLC 条件- 试验 1 流动相：乙腈：20mM 磷酸钾缓冲液 pH 2.5 (65:35) 流速: 1.0mL/min 柱温: °C 紫外检测器: 254nm 进样量: 10µL 样品(mg/mL): 尿嘧啶(0.025), 3-丁基吡啶 (0.067),苯酚 (0.90), 4-苯基丁酸 (2.1),N,N-二乙基间甲苯酰胺 (0.66), 1,4二羟基蒽醌(0.20), 丙基苯 (5.0), 丁基苯 (6.7) 用流动相溶解

70 HPLC 条件- 试验 2 流动相:乙腈:20mM 磷酸盐缓冲液,pH 7.0 (65:35) 流速: 1.0mL/min 柱温: 30°C 紫外检测器: 254nm 进样体积: 10µL 样品 (mg/mL): 尿嘧啶(0.05), 3-丁基吡啶(0.02), 苯酚(1.0), 4-苯基丁胺(4.0),N,N-二乙基间甲苯酰胺(1.0), 1,4-二羟基蒽醌 (0.20), 丙基苯 (4.0),丁基苯(4.0) 用流动相溶解

71 HPLC 条件 –试验3 流动相: 乙腈:H2O (85:15) 流动相: 2.0mL/min 柱温: 25°C 紫外检测器: 254nm
样品: 苯[a]芘,1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘, 菲[3,4-c]并菲,丙酮

72 pH 2.5 的色谱图 1a 碱灭活 1b 非碱灭活 1. 尿嘧啶 2. 3-丁基吡啶 3. 苯酚 4. 4-苯基丁酸
5. N,N-二乙基间甲苯酰胺 (DEET) 6. 1,4二羟基蒽醌 7. 丙基苯 8. 丁基苯 Column: Alltima™ C18, 5m, 150 x 4.6mm Column: Adsorbosphere™ C18, 5m, 150 x 4.6mm

73 pH 7 的色谱图 2a 碱灭活 2b 非碱灭活 1. 尿嘧啶 2. 苯酚 3. 4-苯基丁胺 4. N,N-二乙基间甲苯酰胺
5. 3-丁基吡啶 6. 1,4二羟基蒽醌 7. 丙基苯 8. 丁基苯 Column: Alltima™ C18, 5m, 150 x 4.6mm Column: Adsorbosphere® C18, 5m, 150 x 4.6mm

74 pH2.5

75 pH7.0

76 3a Platinum™ C18, 5µm, 150 x 4.6mm 3b Nucleosil® C18 AB, 5µm, 150 x 4.6mm 3c Inertsil® ODS-2, 5µm, 150 x 4.5mm 1. 丙酮 2. 苯[a]芘 3. 菲[3,4-c]并菲 4. 1,2:3,4:5,6:7,8-四苯基萘

77 5 色谱分析中各种图谱现象的判断 5.1 基线噪音的产生和处理
可能产生的原因及处理办法 1 流动池脏，用极性试剂清洗。当有填料进入，拆开流通池。 2 检测器灯有问题，如能量偏低，更换氘灯。 3 周期性的波动，则起源于泵的脉冲，检修泵或更换垫片等。 4 温度对检测器的影响，控制温度。 5 气泡经过检测器，用大流量冲洗。 6 可能难出峰的样品连续不断出来，用强极性流动相冲柱。 7 流动相本底高，如水的纯度不够，换超纯水。或试剂纯度不够， 换色谱纯的试剂。 8 注意数据采样和连接问题。 Time (min.)

78 5.2 基线漂移（上漂和下漂） 1 柱中的流动相没有平衡，延长平衡时间，尤其在流动相中添加了有紫外吸收的添加剂。
2 在梯度洗脱中，基线上漂是正常的，在空白梯度中有可能是柱子中有杂质洗出。其次是流动相中有干扰物。换流动相。 3 温度不稳定（示差检测器），控温。 4 在等度分析中，样品缓慢洗出，改变淋洗液强度或用梯度分析。 5 样品进入检测器，吸附在池中，可能每进样一次，本底一次比一次高，很少见。

79 5.3 倒峰的产生和消除 1 柱切换的脉冲效应，一般不是很明显，必要时考虑换阀。
1 柱切换的脉冲效应，一般不是很明显，必要时考虑换阀。 2 在低波长分析时，流动相本底比较高时，而样品用本底低的流动相溶解，肯定出现倒峰，其程度同进样量和本底差有关。解决办法，用流动相溶解样品，减少进样量，消除倒峰的影响。高波长时,影响比较小。 3 如果倒峰不影响峰的分离，对外标法定量不影响。但影响面积归一化法。 4 样品中有比流动相本底低的物质存在，如无机盐等，将出倒峰。这种情况下，倒峰的位置不一定在死体积位置出现（大多数在死体积位置出现）。

80 5.4 鬼峰的产生和消除 1 样品分析时峰没出完，在下一针或下下一针出现，判断办法，延长分析时间，计算可能出现的保留时间。然后调整流动相。
2 连续进样，在某个位置出现忽高忽低的峰，最可能是进样针污染，清洗进样针，注意黑垢的干扰，有些样品易残留在针管里。可重新取样分析。 3 定量管污染，处理方法同上。 4 在死体积位置出现的小峰，可能是柱切换造成的。 5 流动相与样品溶剂不一致，也会出现鬼峰，尤其在低波长时，出现位置在死体积的地方。 6 气泡，如果有小气泡通过流通池，也出现随机的假峰，大气泡存在，其出现的峰往往直上直下，脱气解决。 7 样品发生变化反应，重新取样快速分析。

81 1 有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的缓冲液或离子对试剂，样品对pH变化极敏感。
5.5 峰前移或退后的判断 1 有规律的变化一般可能是流动相没平衡，如低浓度的缓冲液或离子对试剂，样品对pH变化极敏感。 2 温度变化，当天气变化快，分析时间长，比较明显，用柱温箱，空调解决此类问题。 3 流动相挥发，尤其用挥发性的酸时，时间长了酸度会发生变化，流动相新鲜配置。 4 仪器尤其泵的运行时间长后，重现性不好，仪器老化，在梯度分析时尤其明显，也可能流速不稳，或有气泡。 5 在分析某样品后，柱子可能发生改性，再次分析重现性变差，清洗或再生柱子。 6 进样浓度不一，溶剂不一，也会造成保留时间不一致。

82 5.6 前沿峰和拖尾峰的判断和处理 5.6.1 前沿峰的产生和处理（对称性小于0.9)
1 色谱柱漏穿，柱效明显偏低，柱压偏低，如所有峰都出现，换柱。 2 样品溶剂极性远大于流动相，局部改变了流动相平衡体系，办法是减少进样量，更换样品溶剂。 3 分离不完全，有大量峰重叠，（如系列物），办法，改变流动相，采用梯度洗脱。

83 5.6.2 拖尾峰的判断和处理（对称性大于1.2） 1 色谱柱柱头塌陷，有死体积，柱效明显下降，所有峰都如此，换柱。 2 色谱柱填料流失，例如C18在碱性流动相中，一般是使用较长时间后造成的，换柱。 3 用C18柱分析碱性化合物，可用BDS柱或未端封尾柱，或在流动相中添加减尾剂（三乙胺等）。 4 过载或超载，有可能在检测器上由于灵敏度差，响应小，办法，减少样品浓度和进样量。 5 保留性太强，出峰太迟，办法，增加洗脱强度。 6 管路有死体积，或连接管路太长，或在管路中有保留。

84 7 分析体系不合理，如苯基多磺酸类的化合物在酸性的有机相中分离，会出现正三角形的峰，解决办法，用离子对试剂，改变pH。
8 在分离过程中，可能发生结构变化，或存在结构互变，办法，用其它分析体系。 9 分离不完全，后面带有小峰，采用梯度或改变流动相。 10 样品溶解体系同流动相不匹配，样品在柱子中析出。

85 5.7 色谱双峰的判断 1 柱头或筛板杜塞，污染，处理办法，清洗筛板或对柱头填料修补。问题是柱效会下降。
2 溶剂极性太强或在二相中差异太大，换溶剂，或减少进样量。 3 过载，减少进样量，或进样体积。 4 采样频率过快，降低采样频率。 5 样品的溶解度，样品难溶于流动相时，会出现。 6 存在互变异构现象，双峰基本齐平。 7 样品存在动态反应，如酸与盐（间苯甲酸与间苯甲酸钠），在特定pH条件下会出双峰。 8 确实是二个组分混合在一起，改变流动相体系。

86 5.8 色谱峰变胖的判断和处理 1 死体积增加，如管路和连接管，可能用粗的代替细的，解决办法，缩短连接管路，用细管。
2 柱效降低，色谱柱受损，换柱。 3 流动相不合理，单一如只用甲醇水体系，没有添加改性剂，pH调节剂，也可能柱子选择有问题。一般除了非极性化合物外，流动相中建议都加盐等化合物，可以提高化合物的分离柱效。 4 溶解与分离体系不一致，如用乙醇溶解样品在甲醇体系中进样，会造成峰位移和峰变宽。 5 大体积进样，在分析柱中进样超过100ul。 6 柱和仪器匹配不合理，如2.1mm内径的色谱柱（包括一体化的柱子，检测器的死体积问题），其管路要求比较细，4.6mm做的好的，2.1的就不行。

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