第24章 疱疹病毒 herpesviruses, HV.

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1 第24章 疱疹病毒 herpesviruses, HV

2 教学目的 掌握 疱疹病毒的致病性 熟悉 疱疹病毒的生物学性状 了解 疱疹病毒的检查方法和防治原则

3 疱疹病毒 (Herpesvirus) 是一类中等大小、结构相似、有包膜的DNA病毒。现已发现114种，分3个亚科 已知的人类疱疹病毒有：
单纯疱疹病毒 1 型和 2 型 （HSV 1 & 2） 水痘—带状疱疹病毒 （VZV） 巨细胞病毒 （CMV） EB病毒 （EBV） 人类疱疹病毒 6型、7型、8型 （HHV 6, 7, 8）

4 正式命名 常用名 病毒亚科 重要生物学性状 所致疾病 人类疱疹病毒1型（HHV-1） 单纯疱疹病毒1型（HSV-1）  繁殖快、杀细胞性感染感觉神经节中潜伏 唇疱疹、龈口炎、角膜结膜炎、脑炎等 人类疱疹病毒2型（HHV-2） 单纯疱疹病毒2型（HSV-2） 同上 生殖器疱疹、新生儿疱疹 人类疱疹病毒3型（HHV-3） 水痘-带状疱疹病毒（VZV） 水痘、带状疱疹、脑炎 人类疱疹病毒4型（HHV-4） Epstein-Barr病毒（EBV）  淋巴细胞中繁殖与潜伏 传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（?）等 人类疱疹病毒5型（HHV-5） 人类巨细胞病毒  常在淋巴细胞、肾脏及分泌腺体中潜伏 先天性巨细胞包涵体病、单核细胞增多症、间质性肺炎、先天性畸形、肝炎 人类疱疹病毒6型（HHV-6） 人类疱疹病毒6型 同人巨细胞病毒 婴儿急疹、间质性肺炎、骨髓抑制 人类疱疹病毒7型（HHV-7） 人类疱疹病毒7型 未明确 人类疱疹病毒8型（HHV-8） 人类疱疹病毒8型 同EB病毒 Kaposi肉瘤 弥猴疱疹病毒1 猿猴B病毒 同HSV 脊髓炎、出血性脑炎

5 疱疹病毒的共同特征 病毒颗粒呈球形，120～300nm。核衣壳约100nm。 20面体立体对称，有包膜 双链线形DNA

6 除EB病毒及HHV-6、HHV-7和HHV8外，均能在人二倍体细胞内复制，产生明显CPE，并有核内嗜酸性包涵体，形成多核巨细胞
多种感染类型: 显性感染 潜伏感染 整合感染 先天性感染

7 Herpes simplex virus, HSV
第一节 单纯疱疹病毒 Herpes simplex virus, HSV

8 单纯疱疹病毒案例 患者，女，20岁。因经常出现口唇黏膜处水疱而就诊，患者发热时口唇周围常起针头大小的小疱，常为一群，也有两三群，自觉有轻度烧灼感，历时1周左右可自愈，反复发作多次，并伴有口腔溃疡、咽炎、舌炎等现象。

9 思考题： 1该患为何种病原体感染？病原体存在于何处？ 2潜伏感染的定义是什么？

10 单纯疱疹病毒 单纯疱疹病毒，由于在感染急性期发生水疱性皮疹即所谓单纯疱疹而得名 包括两个血清型 HSV-1 HSV-2

11 一、生物学性状

12 生物学性状 典型的疱疹病毒科病毒特征 HSV有两个血清型，即HSV-1和HSV-2。 两者DNA的同源性约为50%
病毒体有六个包膜相关糖蛋白：gpB、 gpC、gpD、gpE、gpG和gpH。gpC是型特 异抗原，只有HSV-1有。gpD是病毒中和 抗原，是亚单位疫苗的备选蛋白

13 在多种细胞增殖，病毒复制快（48h），出现细胞肿胀变圆和核内嗜酸性包涵体CPE

14 二、致病性与免疫性

15 密切接触传播：唾液、阴道分泌物、疱疹液，接吻，共用杯子，牙刷等。
传播途径 性接触 垂直传播

16 上皮细胞内复制，水疱浆液充满病毒颗粒，细胞碎片，基底部多核巨细胞；神经细胞则为潜伏感染。
HSV感染较普遍 密切接触和性接触 经粘膜和破损皮肤 上皮细胞内复制，水疱浆液充满病毒颗粒，细胞碎片，基底部多核巨细胞；神经细胞则为潜伏感染。 皮肤损伤性水疱

17 原发感染 表现：粘膜与皮肤的局部疱疹HSV-1：腰以上感染为主 唇疱疹 龈口炎 角膜结膜炎等

18 HSV-2：腰以下及生殖器感染为主 生殖系统疱疹、新生儿疱疹等

19 潜伏感染 原发感染后, HSV由感觉神经 感觉神经节 HSV-1: 三叉神经节和颈上神经节 HSV-2: 骶神经节
潜伏感染　 原发感染后, HSV由感觉神经 感觉神经节 HSV-1: 三叉神经节和颈上神经节 HSV-2: 骶神经节 潜伏的HSV不复制，对抗病毒药物不敏感

20 复发性感染 非特异性刺激：发热、月经、感染等 激活潜伏病毒 沿感觉神经纤维 下行到末梢 感染粘膜或皮肤上皮细胞 免疫记忆反应
复发性感染　 非特异性刺激：发热、月经、感染等 激活潜伏病毒 沿感觉神经纤维 下行到末梢 感染粘膜或皮肤上皮细胞 免疫记忆反应 病程短, 组织损伤轻, 感染更局限

21 先天性感染及新生儿感染： 妊娠期妇女（HSV-1） 影响胚胎细胞的有丝分裂 胎儿畸形、智力低下、流产 。分娩 新生儿疱疹

22 HSV-2可能引起宫颈癌 患过生殖器疱疹的妇女，宫颈癌发病率高 用免疫荧光检查癌组织HSV-2抗原 患者HSV-2抗体效价高
宫颈疱疹与宫颈癌好发部位相似 分子杂交试验发现HSV-2基因片段 尚不能作出结论。HSV-2可能是一种辅助致癌因子，或是一种与之无关的“过客”病毒

23 免疫 IFN和NK细胞：限制原发感染发展 中和抗体：阻断病毒扩散及潜伏感染 细胞免疫：控制和消除HSV感染

24 三、微生物学检查法

25 检测核酸 PCR或原位杂交 检测抗原 荧光素或酶标记抗体染色 分离病毒 标本：水疱液、唾液 细胞：BHK-21，Vero CPE：细胞肿胀；融合细胞；包涵体

26 防治原则 预防 避免同患者接触 防止医院内感染 剖腹产预防新生儿感染 HSV有致癌可能性，减毒活疫苗和死疫苗不宜用于人体
避免同患者接触 防止医院内感染 剖腹产预防新生儿感染 HSV有致癌可能性，减毒活疫苗和死疫苗不宜用于人体 包膜蛋白（提纯的gG、gD）亚单位疫苗 基因重组疫苗、多肽疫苗治疗正研制 国内用HSV gC gD单克隆抗体制成滴眼液，用于治疗疱疹性角膜炎，取得显著疗效 无环鸟苷（ACV）对疱疹病毒选择性很强的药物

27 单纯疱疹病毒案例 患者，女，20岁。因经常出现口唇黏膜处水疱而就诊，患者发热时口唇周围常起针头大小的小疱，常为一群，也有两三群，自觉有轻度烧灼感，历时1周左右可自愈，反复发作多次，并伴有口腔溃疡、咽炎、舌炎等现象。

28 思考题： 1该患为何种病原体感染？病原体存在于何处？ 2潜伏感染的定义是什么？

29 案例提示 根据临床表现为单纯疱疹病毒——1型感染。不同的疱疹病毒其体内潜伏部位不同，ＨＳＶ——1主要潜伏于三叉神经节或颈上神经节，ＨＳＶ——2潜伏于骶神经节，ＥＢＶ主要潜伏于Ｂ淋巴细胞内。

30 原发感染后少数病毒不被清除，以非活化状态存留于机体内。病毒不增殖，也不破坏细胞，与宿主细胞处于暂时平衡状态。一旦病毒被再激活，可转为显性感染，疾病复发。

31 Varicella zoster virus
第二节 水痘-带状疱疹病毒 Varicella zoster virus （VZV）

32 水痘带状疱疹病毒案例 患者，男，58岁。因感冒发热2天后胸部皮肤产生水疱疹，水疱逐渐增多并显著疼痛就诊。查体见患者胸部皮肤有片状水疱，沿肋缘分布形成带状。

33 思考题： 1该患为何种病原体感染？ 2该病怎样进行预防和治疗？

34 水痘－带状疱疹病毒（VZV） 在儿童初次感染时引起水痘
（Varicella），恢复后病毒潜伏在体内，青春期或成年以后少数人复发可引起带状疱疹（Zoster），故称为水痘－带状疱疹病毒 （Varicella-Zoster Virus）

35 一、生物学性状 与HSV相似： ①潜伏神经细胞，引起复发感染 ②细胞免疫限制和防止重症水痘 ③皮肤损伤以水疱为特征 与HSV不同：
①呼吸道感染 ②通过病毒血症播散至皮肤

36 二、致病性与免疫性 水痘和带状疱疹

37 致病性 传染源主要是患者，水痘患者急性期水疱内容物及上呼吸道分泌物、或带状疱疹患者水疱内容物都含有病毒 病毒借飞沫经呼吸道或接触传播
好发年龄为3～9岁，多在冬季春季流行

38 原发感染：水痘，一般病情较轻 潜伏感染： 原发感染后，病毒潜伏于脊髓后根神经节或颅神经的感觉神经节。以后如机体免疫力下降，病毒被激活，病毒沿神经轴突下行到所支配的皮肤细胞内增殖，发生疱疹，排列呈带状，称带状疱疹 发生于身体的一侧，以躯干中线为界，好发部位为胸、腹和面部 多见于成年人，特别是40岁以上成年人

39 水痘(Chicken Pox) 病毒 经呼吸道、结膜、皮肤等处侵入人体 皮肤广泛发生丘疹，水疱疹和脓疱疹 先在局部淋巴结增殖
进入血液散布到各个内脏继续大量增殖 2～3周潜伏期

40 带状疱疹（Shingles） 儿童时期患过水痘愈合 在皮肤上沿着感觉神经的通路发生串联的水疱疹，形似带状
病毒潜伏在脊髓后根神经节或脑感染神经节中 该神经所支配的皮肤细胞内增殖 病毒沿感觉神经轴索下行 机体免疫力下降等条件刺激

41 免疫性 儿童患水痘后，机体产生持久的特异性细胞免疫和体液免疫，极少再患水痘
病毒中和抗体和细胞免疫不能有效地清除潜伏于神经节中的病毒，故不能阻止病毒被激活而发生带状疱疹

42 三、微生物学检查法与防治 诊断：似HSV 治疗：① 无环鸟苷 ②IFN：限制疾病 预防：减毒活疫苗

43 防治原则 VZV减毒活疫苗预防水痘感染和传播有良好效果 治疗可用无环鸟苷、阿糖腺苷和高剂量干扰素

44 水痘带状疱疹病毒案例 患者，男，58岁。因感冒发热2天后胸部皮肤产生水疱疹，水疱逐渐增多并显著疼痛就诊。查体见患者胸部皮肤有片状水疱，沿肋缘分布形成带状。

45 思考题： 1该患为何种病原体感染？ 2该病怎样进行预防和治疗？

46 提示 根据临床表现为单纯疱疹病毒——2型感染。

47 提示 VZV减毒活疫苗预防水痘感染和传播有良好效果，接种对象为1岁以上末患过水痘的儿童和成人。对免疫功能低下者可用高效价人免疫球蛋白进行紧急预防。 治疗可用无环鸟苷、阿糖腺苷和高剂量干扰素

48 Human cytomegalovirus
第三节 人巨细胞病毒 Human cytomegalovirus （HCMV）

49 人类巨细胞病毒（HCMV） 1956年Smith等首先用组织培养方法从患者腺体组织培养中分离出病毒。由于感染的细胞肿大并具有巨大的核内包涵体故得名 是巨细胞包涵体病的病原体 CMV多为潜伏感染，常可由怀孕、器官移植、免疫抑制、艾滋病等因素被激活

50 一、生物学性状 形态结构：与HSV极相似 宿主范围： 较窄，不感染其它动物；仅成纤维细胞中增殖。

51 生物学性状 典型疱疹病毒结构 对宿主或培养的组织细胞感染有高度的种属特异性：即HCMV只能感染人。只能在人成纤维细胞增殖
复制周期为36～48h（增殖缓慢），其特点是细胞变圆、膨胀、核变大、形成巨大细胞，核内出现周围绕有一轮鹰眼状大型嗜酸性包涵体（Owl’s eye inclusion body）

52 致病性 潜伏部位 唾液腺、乳腺、肾脏、白细胞及其他腺体 长期或间歇地从尿液、唾液、泪液、乳汁、精液、宫颈及阴道分泌物排出病毒

53 传播环节 传染源 患者及无症状隐性感染者 传染方式 胎盘产道 密切接触，通过口口或手口传播 输血 器官移植

54 先天性感染（宫内感染） 通过胎盘感染胎儿。发生率为0.5%~2.5%，CMV是能引起先天性感染的主要病毒之一
只有少部分（<10%）感染者表现症状，主要临床表现是巨细胞包涵体病（黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血、紫癜等）， 极少数患儿表现为先天性畸形（小头智力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等）

55 围生期感染 经产道感染，或出生后数周由母体的病毒（尿或乳汁中的病毒），或护理人员排出的病毒所引起的感染
多数无症状或症状轻微，表现为轻声度或明显呼吸障碍、肝功损害 通常不表现神经损伤，预后良好

56 免疫功能低下的病人感染 发生于长期免疫抑制剂治疗、器官移植、AIDS、白血病、淋巴瘤等患者 是由于体内原有的潜伏HCMV被激活
症状主要是肺炎、视网膜炎、脑炎、脑膜炎等，预后不好

57 输血感染 输入大量含有CMV的新鲜血液，可发生输血后的单核细胞增多症和肝炎等
HCMV导致的单核细胞增多症检测不到嗜异性抗体和EBV相关抗体，可籍此区别与EBV所致的单核细胞增多症 预后良好

58 接触感染 唾液、乳汁、尿、精液、宫颈分泌物存在HCMV，通过接吻、性接触、哺乳等方式传染。

59 细胞转化与致癌潜能 HCMV基因组的DNA 片段，体外可转化地鼠胚和人胚成纤维细胞。接种乳鼠可形成肿瘤。
宫颈癌、前列腺癌、结肠癌和Kaposi 肉瘤组织检出HCMV的DNA 序列。

60 三、微生物学检查法 细胞培养：成纤维细胞中增殖，生长慢，CPE需2～6周。 HCMVCPE 包涵体
ELISA：HCMV-IgM；近期感染；胎儿感染

61 防治原则 丙氧鸟苷（ganciclovir DHPG）有防止CMV扩散作用 耐丙氧鸟苷的CMV感染可选用磷甲酸钠，但效果比前者差

62 Epstein-Barr virus，EBV

63 EB病毒（Epetein-Barr virus）
Burkkit先生在研究非洲中部的一种发生于儿童的恶性淋巴瘤时曾预测该病是一种病毒感染性疾病。1964年加拿大学者Epstein和Barr从这种恶性淋巴瘤体外培养的淋巴瘤细系中，用电镜观察到一种新的人类疱疹病毒，后被命名为EB病毒

64 一、生物学性状 形态结构类似HSV

65 生物学性状 典型疱疹病毒，但抗原结构与其他疱疹病毒不同
常规方法不能培养。仅能在CD21+的B淋巴细胞中增殖，转化为可长期传代的类淋巴母细胞株。是一种嗜B细胞的疱疹病毒 CD21分子是该病毒的受体，故含CD21的粘膜上皮细胞和B淋巴细胞是该病毒的宿主

66 增殖性感染产生的抗原： 早期抗原（early antigen，EA）： DNA聚合酶活性, 表示EBV增殖 EA抗体：早期抗体, 持续几个月，表示近期感染。

67 衣壳抗原（VCA）： 结构蛋白，存在细胞质和细胞核 VCA-IgM出现早，消失快 VCA-IgG出现晚，持续几年 EBV膜抗原（MA）： 在细胞表面，属包膜糖蛋白 MA-IgM表示近期感染 MA-IgG可持续存在

68 选择性表达潜伏期抗原，刺激B细胞增生或永生化
潜伏感染 EBV感染B细胞或上皮细胞 细胞含EBV基因组 (游离或整合) 选择性表达潜伏期抗原，刺激B细胞增生或永生化

69 核抗原（EBNA） B细胞核内，为DNA结合蛋白 感染细胞逃避CTL杀伤 与细胞永生化有关 EBNA抗体：感染晚期持续存在
EBV潜伏期抗原 核抗原（EBNA） B细胞核内，为DNA结合蛋白 感染细胞逃避CTL杀伤 与细胞永生化有关 EBNA抗体：感染晚期持续存在 潜伏膜蛋白（LMP） 在B细胞表面, 致癌蛋白 改变细胞功能, 抑制细胞凋亡 阻止潜伏病毒激活功能

70 二、致病性与免疫性 EB病毒在人群中广泛感染 我国3～5岁儿童感染率达90%以上 主要通过唾液传播，也可经输血传染
EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞 感染B细胞进入血循环可造成全身性感染 病毒可长期潜伏

71 致病性 传染性单核细胞增多症 初次感染大剂量病毒，多见青少年，是一种急性全身淋巴细胞增生性疾病
症状为发热、咽炎、颈淋巴腺炎、肝脾肿大、血液中大量异形淋巴细胞 持续数月后自愈，预后良好

72 非洲儿童淋巴瘤（即Burkitt淋巴瘤）
于中非、新几内亚和美洲温热带地区呈地方性流行 多见于5～12岁儿童 好发部位为颜面、腭部 所有BL病人血清均含EBV抗体，其中80%以上滴度高于正常人 在肿瘤组织中发现EBV基因组 100%死亡率

73 鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）
地区性分部，主要东南亚和华南广东省 40岁以上的中老年人 从鼻咽癌活检组织中找到EBV 鼻咽癌患者血清EBV相关抗原的抗体效价高于正常人 NPC患者EBV潜伏感染时间通常很长，在30年左右 还不能认为EBV是鼻咽癌唯一致病因素，可能是多种综合因素中的一种

74 免疫性 EBV在人群中广泛存在，成人抗体的阳性率达90%以上 出现中和抗体，能阻止外源性病毒再感染

75 三、微生物学检查法 异嗜性抗体的检测 EBV特异性抗体检测

76 微生物学检查 EBV分离培养困难 可用核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物 血清学诊断
EBV特异性抗体的检测 检测病毒VCA－IgA或EA－IgA抗体，滴度≥1：5～1：10有诊断意义 异嗜性抗体凝集试验 用于传染性单核白细胞增多症的辅助诊断

77 防治原则 我国用基因工程方法构建的同时表达EBV gp320和HBsAg的疫苗，重点使用在鼻咽癌高发区

78 EB病毒感染与多发性硬化症的关系研究 临床病原教研室：孙艳

79 课题来源 该课题分别列为黑龙江省教育厅一般科研项目和齐齐哈尔市科技局指令项目，获项目经费1.5万元，学院配备1.5万元。

80 研究工作概述 该课题于2006年9月启动2008年12月完成全部实验

81 研究工作概述 1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相关抗体的检测及EBV核酸的PCR检测
2.小鼠MS动物模型制备及EB病毒感染导致的神经系统病理变化的研究

82 研究背景 多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）是一种中枢神经系统的脱髓鞘性疾病，病变累及的部位为脑和脊髓。特点为病灶多发，常有缓解和复发，病残性大。表现为多种神经系统的症状和体征。有复发缓解型、继发进展型、原发进展型、复发进展型和良性MS等数种类型，多见于欧洲及北美国家，在西方社会MS是造成青壮年神经性残疾中仅次于外伤的第二大因素。

83 过去认为此病在我国较罕见，但近年来随着诊断手段和医疗水平的不断提高，陆续有此类病例报道，并且发病率呈上升趋势，尤其是在我国高纬度地区，如黑龙江发病率较高。尽管目前对MS的病因及病理机制尚未完全明了，但认为MS 的发病与遗传、病毒、免疫、环境地理等因素有关，是多因素共同作用的结果。

84 关于EB病毒感染与多发性硬化症的关系研究，国外研究只证明，EBV感染与MS发病高度相关，而国内目前尚属空白，至今没有直接的实验证据证明EBV感染可以导致MS二者研究的报道，如果我们能开展此项研究将能填补国内研究领域的空白。

85 EB病毒(Epstein Barrvirus,EBV)EB病毒是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒,主要侵犯B细胞。EB病毒基因组编码6个抗原蛋白,膜壳抗原(VCA)、膜抗原(MA)、早期抗原(EA,可分为弥散成分D和局限成分R)、补体结合抗原(即可溶性抗原S)、EB病毒核抗原(EBNA,分EBNA 1和EBNA 2)和淋巴细胞检测的膜抗原(LY DMA)。

86 EBV与人类许多疾病密切相关，如：传染性单核细胞增多症，EBV相关嗜血细胞综合症，鼻咽癌，淋巴瘤等。目前国外研究只证明EBV感染与MS发病高度相关，国内目前尚属空白，至今没有直接的实验证据证明EBV感染可以导致MS的研究。

87 本课题将从临床抗体检测、病毒核酸检测、 MS小鼠神经系统病理变化等方面研究EBV感染与MS发病间的关系，将为探讨MS致病机制和治疗提供理论基础。

88 主要试剂和主要仪器 豚鼠由哈尔滨兽医研究所提供。
ELISA法EBV IgG检测试剂盒（上海生物制品研究所）、多功能酶标仪（奥地利迪肯公司产品）、EBV-DNA-PCR试剂盒(EBV-DNA：269bp,华美生物工程公司)、PCR仪(美国MJ公司产品)、凝胶成像系统、垂直电泳仪 豚鼠由哈尔滨兽医研究所提供。

89 实 验 方 法 1.通过酶免疫法检测对临床MS患者的CSF中EBV特异的IgG水平，对MS患者CSF中EBV核酸的检测。
实 验 方 法 1.通过酶免疫法检测对临床MS患者的CSF中EBV特异的IgG水平，对MS患者CSF中EBV核酸的检测。 2. 构建动物模型，将灭活EBV和EBV提取蛋白接种小鼠足垫，观查神经系统病理变化。

90 实 验 方 法 1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相关抗体的检测及EBV核酸的PCR检测 1.1研究对象
实 验 方 法 1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相关抗体的检测及EBV核酸的PCR检测 1.1研究对象 MS组：选择临床确诊为MS的患者26例，符合Poster等制定的MS诊断标准，男10例，女16例，年龄12~72岁，平均40.1±13.6岁。 对照组：4例为紧张性头痛及5例神经衰弱患者，17例为腰麻的痔疮或肛瘘手术患者，男11例，女15例，年龄19~71岁，平均43.2±13.5岁。 MS组与正常对照组两组间患者的年龄、性别间具有均衡性。

91 实 验 方 法 1.2实验方法 收集MS组和对照组CSF标本，均在采集30分钟内放入-70℃冰箱中保存备用。
实 验 方 法 1.2实验方法 收集MS组和对照组CSF标本，均在采集30分钟内放入-70℃冰箱中保存备用。 1.2.1 ELISA法检测脑脊液（CSF）中IgG 严格按照ELISA法EBV IgG检测试剂盒说明书的流程操作，用兔抗人IgG（1mg/ml）包被ELISA板后，加入待测脑脊液（CSF）和HRP标记的羊抗人IgG（1：5000），用DAB显色。用酶标仪于波长490nm测定光吸收值（A490）, IgG浓度与A490值成正比。检测结果采用SSPS for windows软件包对数据结果进行统计分析，两组间的比较采用t检验，以P＜0.05表示有显著差异。

92 实 验 方 法 1.2.2 PCR技术检测MS患者脑脊液（CSF）中EBV-DNA
实 验 方 法 1.2.2 PCR技术检测MS患者脑脊液（CSF）中EBV-DNA 脑脊液（CSF）模板处理方法：取脑脊液（CSF）2ml,用PBS液按等倍稀释为1：4，稀释过程需摇匀，用A法[17]提取模板DNA。取5ul用于常规PCR扩增。PCR扩增参数为： 94℃，2min；93℃，30s；55℃, 45s;72℃, 45s；35个循环后，72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。每批实验均设EBV—DNA阳性质粒对照和无模板的阴性对照。

93 实 验 方 法 2.小鼠MS动物模型制备及EB病毒感染导致的神经系统病理变化的研究
实 验 方 法 2.小鼠MS动物模型制备及EB病毒感染导致的神经系统病理变化的研究 将灭活的EBV和EBV的提取蛋白分别接种小鼠足垫。病理和免疫组化观察小鼠是否因此导致神经系统发生MS病理变化，从而找到MS患者与EB病毒感染关系的依据。 2.1 动物 豚鼠由哈尔滨兽医研究所提供30 只， 2.5 月龄, 雌雄各半, 体重350g 左右。

94 实 验 方 法 2.2 EBV的制备 EBV的制备及灭活 将B95－8细胞株用RPMI1640(含10%胎牛血清和2mmol/L谷氨酰胺)调整细胞密度至1×109个细胞/L,接种于培养瓶中，隔日半量换液,并适时进行传代培养。将培养的细胞饥饿14天后,收集培养上清500ml,于4℃以 22000r/min离心1小时。弃上清,用10mlIMDM培养基重悬沉淀,并浓集50倍,0.45μm滤膜过滤。

95 实 验 方 法 2.3 MS动物模型的制备　 实验分两组: (1)实验组,21只，取EBV悬液,加福(氏) 完全佐剂(CFA ) , 乳化后按体重注入豚鼠后足掌, 抗原量约为按体重0.66μg/ g。免疫后约8～ 9 天发病, 发病动物出现不同程度肢体无力, 体重减轻, 继之瘫痪, 伴有尿便障碍, 有的抽搐死亡。 (2) 对照组，9只，取EBV悬液5ml56℃加热灭活60分钟，加CFA注入, 此组动物不发病。

96 实 验 方 法 2.5 组织病理 HE 染色及W eil 铁矾苏木素染色。 2.6 半薄切片及超薄切片 哈尔滨医科大学电镜室制备。
实 验 方 法 2.4 取材　动物处死后立即将脑和脊髓取出, 除留少量组织置于3% (体积分数) 戊二醛中, 其余均置于40 g/L 的多聚甲醛中固定, 固定后2 周取材, 取脑室周围的脑实质, 脊髓分颈、胸、腰3 段。 2.5 组织病理　HE 染色及W eil 铁矾苏木素染色。 2.6 半薄切片及超薄切片　哈尔滨医科大学电镜室制备。

97 实验结果 1.脑脊液（CSF）中IgG的检测 ELISA法检测MS组和正常对照组脑脊液（CSF）中IgG含量，MS组脑脊液（CSF）中IgG含量平均为（x±s）：0.026±0.002，（26例临床确诊为MS患者CSF中IgG含量在0.016~0.047ng/ml之间）；正常对照组脑脊液（CSF）中IgG含量平均为（x±s）：0.005±0.002（26例正常对照组CSF中IgG含量在0.002~0.008ng/ml之间）。以EBV IgG 4倍升高作为诊断依据。 结果：MS组CSF中IgG含量异常的百分率为76.93%（20/26）；对照组CSF中IgG含量异常的百分率为0。

98 实验结果 2 .PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，并以PCR Marker(x174)为分子标准参照物，以PCR扩增产物在269bp处有扩增条带者为EBV-DNA阳性，反之为阴性，电泳结果见图1-4。MS组EBV-DNA阳性率为94.6%（24/26），正常对照组EBV-DNA阳性率为0。 T检验结果证实：MS组与正常对照组EBV-DNA阳性率有显著性差异（P＜0.01）。

99 PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
P N 图1 MS组EBV-DNA PCR扩增结果 Fig1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of EBV-DNA P. positive control;N. negative control；Line1-9. PCR products of MS group(9, negative)

100 PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
M 图2 MS组EBV-DNA PCR扩增结果 Fig2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of EBV-DNA PCR products of MS group; M. DNA MarkerΦX174

101 PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
M 图3 MS组EBV-DNA PCR扩增结果 Fig3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of EBV-DNA PCR products of MS group; M. DNA MarkerΦX174

102 PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
M 图4 MS组EBV-DNA PCR扩增结果 Fig4 Agarose gel electrophoresis of PCR product of EBV-DNA PCR products of MS group; M. DNA MarkerΦX174 （25：negative）

103 PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA
P N 图1 MS组EBV-DNA PCR扩增结果 Fig1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of EBV-DNA P. positive control;N. negative control；Line1-9. PCR products of MS group(9, negative)

104 实验结果 3 .光镜结果　对照组的神经组织病理检查未见异常, 这与此组未出现临床症状吻合。实验组动物大体脑组织可见脑膜血管充血, 珠网膜下腔轻度混浊, 脑横切面可见呈针尖状的小血管充血, 弥漫分布。MS 动物的组织病理学变化主要表现为急性血管炎伴周围髓鞘脱失, 脊髓实质内、珠网膜下腔及侧脑室脉络丛小血管充血, 管周有大量炎细胞浸润, 形成“袖套”(cuffing) 状改变(图1) , 发病初期主要为中性粒细胞浸润, 继之以淋巴细胞浸润为主并有少量单核细胞。

105 Knobler等原位组织化学检测显示: 病变部位浸润的淋巴细胞以辅助T 淋巴细胞和巨噬细胞/小胶质细胞为主,而细胞毒性T 淋巴细胞/抑制T 淋巴细胞和B 淋巴细胞罕见, 小血管管壁增厚, 管周间隙有浆液渗出。病灶播散在CNS 白质内, 病灶均累及小静脉, 有的小静脉破裂, 周围少量出血, 可见白细胞附壁或正通过管壁, 或进而游出血管向炎性区移动。脑膜和脊髓膜亦有炎细胞浸润。侧脑室旁白质尤其侧脑室角周围白质及脊髓后联合、侧角髓鞘肿胀, 崩解消失,轴突肿胀, 偶有轴突消失(图2) , 并可见大量格子细胞存在。神经元细胞无明显改变, 有的出现卫星现象。以上病理改变符合文献报道。

106 Fig 1 Inflammatory infiltration around blood vessels
图1　血管周围炎性浸润 　　Fig 1 　Inflammatory infiltration around blood vessels × ×15 × ×40

107 图2　白质脱髓鞘 Fig 2　Demyelination in white matter

108 实验结果 4. 电镜结果　电镜下观察MS发病动物, 病变分布不规则, 脱髓鞘改变以血管周围明显, 大部分髓鞘环形结构呈松散状, 部分区域斑块状脱落, 明暗相间消失(图3) , 轴突细胞器消失, 血管基膜增厚, 部分区域局灶性坏死。神经元细胞尼(氏) 小体消失, 内质网扩张脱颗粒。

109 图3 髓鞘呈松散状（×3000） Fig 3 Structure of myelin sheath is divergent

110 讨 论 MS是一种病因不明的人类中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病，致病因素说法不一。目前，MS与病毒感染关系及免疫调节缺陷日益被国内外学者重视。本文应用ELISA法检测了26例临床确诊为MS患者的CSF中EBV特异的IgG的产生，并采用PCR技术检测了MS患者CSF中EBV的DNA以观察MS患者CSF中EBV的感染情况。结果发现，在26例临床确诊为MS患者的CSF中发现IgG增高和EBV—DNA阳性较多见

111 另外，EB病毒感染导致CNS神经系统发生MS的病理改变是确定MS患者与EB病毒感染关系的客观依据, 以此为基础进行免疫组化研究对探讨MS的发病机制具有重要的意义。因此我们将灭活的EBV和EBV的提取蛋白分别接种小鼠足垫，病理和免疫组化观察小鼠是否因此导致神经系统发生MS病理变化，结果表明MS 动物的组织已出现明显的病理学变化。以上实验结果均与国内外报道[9、10、11]的二者相关性的结果相一致

112 讨 论 另外，Cepoks等采用蛋白芯片的方法筛选MS患者CSF中IgG的对应表位，结果显示，EBV的两种抗原BRRF-2、EBNA-1与MS中枢神经系统的IgG具有最高的反应性，这表明，EBV感染与MS发病高度相关。由此我们认为本研究为证明EBV感染是导致MS的重要因素及感染EBV的MS患者增加体液和细胞免疫提供了证据，但感染EBV后怎样导致MS发生的机制不明。

113 讨 论 国外有报道表明正常人群有少数EBV携带者；Szczucinski A等研究发现，在MS患者中可能存在EBV和HHV-6双重感染，且感染率和抗体滴度均较高，并且两种病毒之间有相关性，因此推测MS发病机制可能是HHV-6首先激活潜在感染的EBV，然后EBV和HHV-6相互激活而引起的结果。但是由病毒感染后引起MS，还是MS的反复发作易患病毒感染，还有待进一步的证实，我们今后的研究重点也将在此方面展开。

114 结 论 一、MS患者CSF中普遍存在EBV感染情况。 二、 EB病毒感染导致CNS神经系统发生MS的病理改变

115 研究工作展望 本项目的最终目标是获得EB病毒和MS感染指标，它对开发研制药物、与其它病毒作用机制上的相互关系、探求与相关性疾病的发病机理及新的治疗途径具有重要意义；利用IgG抗体，用于今后疾病诊断中；利用核酸制备疫苗，用于今后疾病预防中，抗体和核酸可作为生物制剂成为产品。

116 Thank 谢谢

117 第五节 其他人疱疹病毒

118 人疱疹病毒6型（HHV-6） 传播途径：通过唾液传播 婴儿玫瑰疹（roseola）： 潜伏期4～7天 高热及呼吸道症状，4天左右热退，颈部、躯干出现斑丘疹，维持24～48小时 。

119 思考题 1.试述人疱疹病毒的类型及所致疾病。 2.为何小儿患水痘，成年后有患带状疱疹的危险？