第五章 创新药物临床前安全评价.

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1 第五章 创新药物临床前安全评价

2 药物临床前安全评价包括很多内容，比如：单次给药毒性试验，多次给药毒性试验，制剂安全性试验，免疫毒性试验，放射性药物评价试验，安全性药理试验，毒代／药代动力学研究，生殖毒性试验，致突变试验，致癌试验等。

3 第一节 急性毒性试验

4 动物急性毒性试验（Acute toxicity test，Single dose toxicity test），研究动物一次或24 小时内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。 急性毒性试验所获得的信息对长期毒性试验剂量的设计和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。

5 基本概念 最大无毒性反应剂量：即未见毒性反应剂量（No observed adverse effect level, NOAEL），指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量。

6 基本概念 最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量。 最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量。

7 基本概念 最小致死剂量（Minimal lethal dose, MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量。 半数致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。

8 研实验设计 急性毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据化合物的结构特点、理化性质、适应症特点和试验目的等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。

9 研究内容 （一）受试物 急性毒性试验的受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。

10 研究内容 （二）动物 种属： 急性毒性试验应采用至少两种哺乳动物。一般应选用一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物进行急性毒性试验。若未采用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应阐明其合理性。

11 研究内容 2. 性别： 通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。若采用单性别动物进行试验，则应阐明其合理性。 3. 年龄： 通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童或可能用于儿童，建议必要时采用幼年动物进行试验。

12 研究内容 4. 动物数： 对于所用的动物数，应根据动物的种属和研究目的来确定。动物数应符合试验方法及其结果分析评价的需要。应在获得尽量多信息的前提下，使用尽量少的动物数。 5. 体重： 动物初始体重不应超过或低于平均体重的20%。

13 研究内容 可根据试验目的及受试物的特点，确定实验动物的性别和年龄等。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。

14 研究内容 （三）给药途径 给药途径不同，受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同，因此需要采用不同给药途径进行急性毒性试验。另外，通过对不同途径给药所得结果进行比较，可以获得一些初步的生物利用度信息。

15 研究内容 （三）给药途径 给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。 经口给药前动物一般应进行一段时间（通常一夜）的禁食，不禁水。

16 研究内容 （四）给药剂量水平 急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到致死水平。总体上，给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性 (危及生命的) 剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。

17 研究内容 （五）观察时间及指标 给药后，一般连续观察至少14 天，观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。

18 研究内容 （六）病理学检查 所有的试验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。

19 数据分析及评价 （一）结果处理和分析 1. 根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量－反应及时间－反应关系。 2. 判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。

20 数据分析及评价 （一）结果处理和分析 3. 根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签名和药品注册申请人盖章的报告及有病变组织的病理照片。

21 数据分析及评价 （一）结果处理和分析 4. 根据不同剂量组各种毒性反应及发生率、动物死亡情况等，确定动物对受试物的无毒性反应剂量和严重毒性反应剂量。 5. 对于需要测定LD50的药物，应采用合理的统计学方法对其进行求算。 6. 说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。

22 数据分析及评价 （二）综合评价 根据各种反应在不同剂量下出现的时间、发生率、剂量-反应关系、不同种属动物及实验室的历史背景数据、病理学检查的结果以及同类药物的特点，判断所出现的反应与药物作用的相关性。

23 数据分析及评价 （二）综合评价 总结受试物的安全范围、出现毒性的严重程度及可恢复性；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查的结果，初步判断毒性作用靶器官。

24 数据分析及评价 （二）综合评价 急性毒性试验的结果可作为后续毒理研究剂量选择的参考，也可提示一些后续毒性研究需要重点观察的指标。此外，根据不同途径给药时动物的反应情况，初步判断受试物的生物利用度，为剂型开发提供参考。

25 急性毒性试验常用试验方法 1. 近似致死剂量法 一般采用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年龄一般为4-6 月龄，猴的年龄一般为2-3 岁。 根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。

26 急性毒性试验常用试验方法 1. 近似致死剂量法 根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。

27 急性毒性试验常用试验方法 2. 最大给药量法 对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24 小时内多次给药(剂量一般不超过5 g/kg 体重)，观察动物出现的反应。一般使用10-20 只动物，连续观察14 天。

28 急性毒性试验常用试验方法 3. 固定剂量法（Fixed-dose procedure） 该方法最初于1984 年由英国毒理学会提出，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。 试验选择5、50、500 和2000mg/kg 四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg 剂量。选择合适剂量后，给受试物后至少应观察2 周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。

29 急性毒性试验常用试验方法

30 急性毒性试验常用试验方法 4. 上下法（阶梯法，序贯法，Up and down method） 其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。

31 急性毒性试验常用试验方法 4. 上下法 该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。

32 急性毒性试验常用试验方法 4. 上下法 该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。

33 急性毒性试验常用试验方法 5. 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design） 在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要8 只动物，分对照组和给药组，每组4 只动物，雌雄各2 只。通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。

34 急性毒性试验常用试验方法 6. 半数致死量法 是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50。

35 第二节 长期毒性试验

36 长期毒性试验（重复给药毒性试验）是药物非临床安全性评价的核心内容，它与急性毒性、生殖毒性以及致癌性等毒理学研究有着密切的联系，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。

37 长期毒性试验具体包括以下五个方面： ①预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、剂量－反应关系和时间－反应关系、可逆性等； ②判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织； ③推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围； ④提示临床试验中需重点监测的指标； ⑤还可以为临床试验中的解毒或解救措施提供参考。

38 基本内容 一、受试物 长期毒性试验应采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应注明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。 在药物开发的过程中，若受试物的制备工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。

39 基本内容 二、实验动物 1. 实验动物种属或品系的选择
一般化学药物的长期毒性试验采用两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。理想的动物应具有以下特点：①对受试物的生物转化与人体相近；②对受试物敏感；③已有大量历史对照数据。

40 基本内容 二、实验动物 1. 实验动物种属或品系的选择
一般化学药物的长期毒性试验采用两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。理想的动物应具有以下特点：①对受试物的生物转化与人体相近；②对受试物敏感；③已有大量历史对照数据。

41 基本内容 二、实验动物 2. 实验动物的质量控制 长期毒性试验一般选择正常、健康和未孕的动物，动物体重差异应在平均体重的20％之内。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。应根据研究期限的长短和受试物临床应用的患者群确定动物的年龄。动物年龄应尽量一致，一般大鼠为6～9 周龄，Beagle 犬为6～12 月龄。

42 基本内容 二、实验动物 3. 实验动物的性别和数量
一般情况下，长期毒性试验中每个试验组应使用相等数量的雌、雄动物。每组动物的数量应能够满足试验结果的分析和评价的需要。一般大鼠为雌、雄各10～30 只，Beagle 犬或猴为雌、雄各3～6 只。

43 基本内容 三、试验方法 （一）试验分组： 一般设三个剂量组和一个对照组。必要时尚需设溶媒对照组。低剂量组原则上应高于同种动物药效有效剂量，在此剂量下，动物不出现毒性反应； 高剂量组原则上应使动物产生明显的或严重的毒性反应，甚至引起少数动物死亡；为观察毒性反应的剂量关系，在高、低剂量组之间应再设1个中剂量组。

44 基本内容 二、试验方法 （二）给药剂量 长期毒性试验一般至少设高、中、低三个剂量给药组和一个溶媒（或辅料）对照组，必要时还需设立空白对照组或阳性对照组。因为理论上群体中毒性反应的发生率随暴露量的增加而增加，所以高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡。低剂量原则上应高于动物药效学试验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应。为考察毒性反应剂量-反应关系，应在高剂量和低剂量之间设立中剂量。

45 基本内容 二、试验方法 （三）给药途径： 原则上应与临床用药途径相同。若用其他途径应说明原因。口服给药一般采用灌胃给予受试药物。如采用将受试药物混入饲料中服用，应提供受试药物与饲料混合的均匀性、受试物的稳定性、有关受试物质量检查及说明动物食入规定受试药物的量等方面的资料，以确保获得准确可靠的试验结果。

46 基本内容 二、试验方法 （三）给药途径： 临床用药途径为静脉注射时，由于给药周期长，大鼠静注有困难时，可用其它适宜的途径代替。 原则上应每天给药。试验周期长的试验，也可采取每周给药6天。每天给药时间应相同。应根据体重增长情况适时调整给药量。

47 基本内容 二、试验方法 （四）给药频率： 原则上长期毒性试验中动物应每天给药，给药期限长（3 个月或以上）的药物每周至少应给药6 天。特殊类型的受试物由于其毒性特点和临床给药方案等原因，应根据具体药物的特点设计给药频率。

48 基本内容 二、试验方法 （五）给药期限： 长期毒性试验的给药期限通常与拟定的临床疗程、临床适应证和用药人群有关。
二、试验方法 （五）给药期限： 长期毒性试验的给药期限通常与拟定的临床疗程、临床适应证和用药人群有关。 临床单次用药的药物，给药期限为2 周的长期毒性试验通常可支持其进行临床试验和生产。 临床疗程不超过2 周的药物，给药期限为1 个月的长期毒性试验通常可支持其进行临床试验和生产。

49 基本内容 二、试验方法 （五）给药期限： 临床疗程超过2 周的药物，可以在临床前一次性进行支持其进入III 期临床试验（及生产）的长期毒性试验；也可以通过不同给药期限的长期毒性试验来分别支持其进入I 期、II 期或III 期临床试验（及生产）。一般1 个月的长期毒性试验可支持用药时间不超过2 周的I期临床试验。

50 基本内容 三、观察、检测指标 1．一般观察： 外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、食量、体重、给药局部反应、狗的心电图变化等。大鼠群养时，应将出现中毒反应的动物取出单笼饲养。发现死亡或濒死动物，应及时尸检。试验期间如动物发生非药物性的疾病反应时，应及时进行隔离处理。

51 基本内容 三、观察、检测指标 2．血液学指标：红细胞、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数及其分类、血小板。 3．血液生化指标：天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、血糖（GLU）、总胆红素（T-BIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（T-CHO）。

52 基本内容 三、观察、检测指标 　4．系统尸解和病理组织学检查： 脏器重量：一般应称取下列脏器和组织的重量并计算脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺。 　　　

53 基本内容 三、观察、检测指标 　4．系统尸解和病理组织学检查： 病理组织学检查：对照组和高剂量组动物及尸检异常者应详细检查，其它剂量组在高剂量组有异常时才进行检查。内容包括：肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、脑垂体、前列腺、脑、脊髓、心、脾、胸骨（骨和骨髓）、肾、肝脏、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸（连附睾）、视神经。

54 基本内容 毒物代谢动力学 毒物代谢动力学（简称毒代动力学）系指结合长期毒性试验进行的考察药物系统暴露的代谢动力学研究。毒代动力学可以描述实验动物的系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系。本指导原则中毒代动力学研究的主要目的在于解释长期毒性试验的结果。

55 基本内容 毒物代谢动力学 毒物代谢动力学（毒代动力学试验应选择合适的时间点采样测定，从而获得药时曲线下面积（AUC ）、峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）等参数。某些药物应结合药物血浆蛋白结合率来评价系统暴露量。毒代动力学数据可以来自长期毒性试验的全部动物，也可以来自部分动物。建议此部分动物应包括低、中、高剂量组的动物，以便估算高剂量药物在动物体内的动力学过程是否属非线性动力学过程。

56 第三节 刺激性、过敏性和溶血性

57 概 念 化学药物刺激性、过敏性和溶血性是指化学药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。

58 研究意义 药 物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH 值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全、有效。

59 研究意义 药 物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH 值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全、有效。

60 刺激性试验 （一）定义 刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。刺激性试验是观察动物的血管、肌肉、皮肤、粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。

61 刺激性试验 （二）皮肤刺激性试验 1. 经皮给药制剂及可能接触皮肤的非口服给药制剂应考虑进行皮肤刺激性试验。 2. 在急性毒性试验、长期毒性试验或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的皮肤刺激性试验。

62 刺激性试验 （四）注射给药部位的刺激性试验 1. 注射剂应考虑进行注射给药部位刺激性试验。 2. 在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过注射给药部位刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的注射给药部位刺激性试验。

63 刺激性试验 （五）眼刺激性试验 1. 眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行眼刺激性试验。 2. 在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过眼刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的眼刺激性试验。

64 过敏性试验 （一）定义 过敏性又称超敏反应，指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。

65 过敏性试验 二、过敏性（超敏反应）分类： Ⅰ型又称快发或速发过敏型，由IgE介导，主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等； Ⅱ型又称细胞毒型或溶细胞型，由IgG 介导，主要表现为库姆斯试验阳性的溶血性贫血，粒细胞减少和血小板减少性紫癜；

66 过敏性试验 过敏性（超敏反应）分类： Ⅲ型又称免疫复合物型或血管炎型，由IgG、IgM 介导，主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等； Ⅳ型又称迟发型或结核菌素型，由T 淋巴细胞介导，主要表现为接触性皮炎。

67 过敏性试验 三、经皮给药过敏性试验 应考察皮肤过敏性反应，通常采用豚鼠封闭斑贴试验Buehler 试验（BT）或豚鼠最大化试验（GPMT)或其他合理的试验方法。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如全身过敏性反应等）。

68 过敏性试验 四、注射给药过敏性试验 通常采用全身主动过敏试验（ASA）和皮肤被动过敏试验（PCA）或其他合理的方法考察全身过敏性反应，采用其他方法应阐明合理性。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏性反应的化合物相同或相似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏性反应（如皮肤过敏性反应等）。

69 过敏性试验 五、其他途径给药过敏性试验 吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药应结合受试物的自身特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。若受试物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如光过敏性反应等）。

70 溶血性试验 （一）定义、分类和目的 溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应； 非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血性试验是观察受试物是否能够引起溶血和红细胞凝聚等反应。

71 试验方法

72 刺激性试验方法 （一）皮肤刺激性试验 选取实验动物——采用同体左右侧自身对比——试验前24 小时脱毛处理——取受试药物涂在动物实验部位及对照区并固定——贴敷结束后清洁给药部位——观察并记录试验结果（红斑、色素、出血及水肿等）。

73 过敏性试验方法 被动皮肤过敏试验（PCA） 选取实验动物——选择容易产生抗体的给药方法给药分离血清制备抗体——稀释抗血清对动物进行皮内注射被动致敏——静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加伊文思兰染料共，激发全身过敏反应——处死各组动物，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小。

74 溶血性试验方法 常规的体外试管法（肉眼观察法） 配置血细胞悬液——配置供试品溶液——将供试品溶液及对照溶液与血细胞悬液混合——每15min观察一次共观测3h——判断有无溶血或凝聚的发生。