分子生物学实验课 1、欢迎大家参加分生实验的学习； 2、学习分生实验的重要性； 3、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣；

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1 分子生物学实验课 1、欢迎大家参加分生实验的学习； 2、学习分生实验的重要性； 3、课堂上守纪律，听老师安排，做实验穿白衣；
4、每组做一份实验 5、上课时间：上午8:00,下午13:00. 6、每天实验结束应主动整理实验台，值日安排。 8:00~8:05

2 实验仪器的使用及注意事项 加样器 离心机

3 一、加样器 1、 用途 2、 如何使用？ 根据取样量，选择合适的加样器。 顶部标有加样器的最大量程，分别为：
 一、加样器 1、 用途 2、 如何使用？ 根据取样量，选择合适的加样器。 顶部标有加样器的最大量程，分别为： 20ul: ~ l 100/200ul: ~ 100/200 l 1000ul: ul ~ l 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?

4 如何调节加样器。 (1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 l: 500 l 100/200 l: 50 l
(2)顺时针调节 --- 读数变小 逆时针调节 --- 读数变大 (3) 加样器读数处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，超出量程，将会损害加样器的精度。 练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?

5 加样器使用步骤(示教及学生练习)： 1）选择加样器 观察读数；调节读数； 2）安装吸头（紧密）； 3）吸取液体
按加样器第一挡；将吸头插入液面下适当深度；松开拇指（缓慢）,吸取液体 4）打出液体 抬起加样器；估计体积是否正确；移入容器；按到加样器第二档；打出液体（匀速）

6 加样器使用注意事项： 1）吸头的安装（紧密） 不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下 2）吸取液体
枪头不能插入过深或过浅，过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 吸取完液体后，估计体积的准确性（加样器可能会不准） 吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！ 3）打出液体 观察吸头内液体是否完全打出

7 二、离心机 1、打开电源 3、样品配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。
4、设定时间(旋转时间转扭，然后自己记时间）。 5、统一离心，逐渐升到要求转速。 六个小组统一用一个离心机 一起离心 1 代表转速盘上方的数据 2 代表下方的数据。

8 实验课的整体安排（两条线） 基因克隆（4天实验） Southern 杂交（3天实验） 基因组DNA提取及酶切后电泳离 2天
1天. 序列查找及引物的设计 基因组DNA提取及酶切后电泳离 3天. RNA提取逆转录及PCR 2天 T载体 分离后DNA经变性及中和后, 转膜 TA 连接, 3天 标记的探针 （回收PCR产物） 4 天 转化， 重组质粒 平板筛选 探针与DNA的杂交 4天 检测杂交信号 5天. 重组质粒提取及酶切

9 本次实验课课件不允许拷贝 PCR引物设计及相关软件数据库的使用 .

10 讲解的内容（上午） 介绍如何查找基因的序列 介绍NCBI的数据库，及检索页面 介绍如何设计PCR引物，及设计引物的注意事项
扩增目的基因的全长 扩增目的基因的任意一部分

11 讲解的内容（上午） 介绍常规的生物学软件的使用 Primer 5.0; Oligo 6.0; Blast; PCRDESIGN；

12 (一）如何查找基因的序列

13 GenBank 数据库 GenBank---序列数据库
GenBank---是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集 网址：

14 1. 打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

15 三种途径可以从Genbank数据库中查到基因的序列
根据文献, 获取基因号，直接检索 2. 从Gene 数据库中直接查找序列 3. 从Nucletide数据库中直接查找序列

16 1. 根据文献 如果你在文献种看到你感兴趣的基因，而且文中还提到在Genbank中的ID号
直接打开 ，在search后下拉框只中选择Nucleotide，把Gnebank ID号（AJ )输入GO前面的文本框中，点Go就可以找到了。 例如： 在2012年发表Biotechlogy letters 文章 (The FMDV serotype bovine O FMDV used to challenge suckling mice was strain O/CHA/2/99 (GenBank NO. AJ ).

17 http://www. ncbi. nlm. nih
，在Search后的下拉框中选择Nucleotide，把Genbank ID号输入GO前面的文本框中，点“GO”，就可以找到他了

18 注意：同学们应该学会看Genbank数据库中基因的ID号

19 2. 从Gene 数据库中直接查找序列 利用limits —高级检索 打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
在search后面的下拉框中选择Gene，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO... 检索42项，哪一条是呢？ （这也许是大多数人对Genbank的第一印象，东西太多，不知道是哪一个。） 利用limits —高级检索

20 Limits的意思其实就是高级检索，你可以在这里对检索词进行很多限制，这样能大大精简查询结果。

21 这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。 提醒：注意一下右侧的基因 相关信息，很有用的。

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23 可以看到Genomic regions, transcripts, and products，这里显示了该基因在基因组中的位置，以及转录本的生成情况：

24 若你只想获得序列（例如设计PCR引物，可以选择FASTA格式。

25 红色框中的才是IFN-gamma的编码序列
在获得FASTA格式的序列后，需要关注一下Genebank 中CDS的信息，来确认该基因的编码序列。

26 IFN- cDNA的编码序列 at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa

27 3. 从Nucletide数据库中直接查找序列
打开 在search后面的下拉框中选择Nucletide，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击GO...

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29 与gene 数据库进入，查找的序列是一样的。

30 Gene 数据库与Nucleotide 数据库查找基因序列的区别
直接查看基因的mRNA序列，查找方式比较简单，快速 2.从Gene 数据库种查找基因序列的优势： 可以查看基因在基因组中的位置 可以查看基因转录本的生成情况，因为有的基因有多种mRNA TNF-alpha 有七个mRNA剪接体。 根据具体的课题需要选择mRNA剪接体，并选择其对应的编码序列

31 (二）如何设计PCR引物

32 介绍内容 什么是引物？ 引物设计的原则是什么？ 介绍常用的引物设计的软件。 引物同源性分析

33 什么是引物？ 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列。 PCR反应需要两种引物，分别为5’引物和3’引物，或称为正向引物和反向引物。
PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合。 PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸。

34 引物设计的原则 首先回顾PCR原理：两条引物与模板结合的位置。 target sequence
负链 3’ 5’ 5’ 5’引物 正链 5’ 3’ 5’ 3’引物 一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补。 另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）。 靠近正链5’端称为5’引物，靠近正链3’端称为3’引物

35 (1)5’引物照抄，3’引物互补倒读 ： gaagagca tcccagtaa
at gaaatataca agt 上游(5’ )引物的结合 gaagagca tcccagtaa 5’ at gaaatataca agt 3’ CTTCTCGTAGGGTCATT 下游(3’ )引物的结合 Genebank上显示的只有一条链的信息，一般情况下显示的是正链（编码链）

36 (2)长度： (3)碱基分布： (4)引物方向：5→3 (5)引物的3端： 严格与模板DNA配对。
特异性序列一般15-18bp.常18-27bp，应≤ 38bp。 (3)碱基分布： 嘌呤，嘧啶随机分布 ；避免出现堆积现象。 GC比值为45-55%。3’端和5’端 引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。 (4)引物方向：5→3 (5)引物的3端： 严格与模板DNA配对。 尤其是引物3′末端连续8个碱基要与模板严格互补。否则影响DNA聚合酶的延伸 引物3′端要避开密码子的第3位

37 (6)引物的5端： 引物5 端修饰包括：加酶切位点； 引入点突变、插入突变、缺失突变序列； 加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。
标记生物素、荧光、地高辛等； 如附加限制酶位点，引入突变位点，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。

38 引物的5’-端设计限制性酶切位点后PCR示意图
第一次循环 第二次循环 第三次循环

39 (7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)
不能有连续5个碱基的互补。引物末端一般不达到3bp。 5´-GTTGACTTGATA 3´-GAACTCT T (8)引物间不应存在互补序列. 尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´

40 (9)比较引物与基因组的同源性 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 利用Blast来分析 引物与基因组的同源性稍后在讲

41 已知IFN- cDNA序列, 你该如何设计引物？
举一个实例： 已知IFN- cDNA序列, 你该如何设计引物？ at gaaatataca agttatatct tggcttttca gctctgcatc gttttgggtt ctcttggctg ttactgccag gacccatatg taaaagaagc agaaaacctt aagaaatatt ttaatgcagg tcattcagat gtagcggata atggaactct tttcttaggc attttgaaga attggaaaga ggagagtgac agaaaaataa tgcagagcca attgtctcc ttttacttca aactttttaa aaactttaaa gatgaccaga gcatccaaaa gagtgtggag accatcaagg aagacatgaa tgtcaagttt ttcaatagca acaaaaagaa acgagatgac ttcgaaaagc tgactaatta ttcggtaact gacttgaatg tccaacgcaa agcaatacat gaactcatcc aagtgatggc tgaactgtcg ccagcagcta aaacagggaa gcgaaaaagg agtcagatgc tgtttcaagg tcgaagagca tcccagtaa

42 1. 设计PCR引物 ---扩增目的基因的全长 2. 设计PCR引物 ---扩增目的基因的部分

43 扩增目的基因的全长 1. 一般情况下， 5’引物需位于编码基因的起始密码子的位置，3’引物 位于编码基因终止子的位置。
2. 引物的5’端需加入多克隆酶切位点，方便后续的基因克隆操作。 3. 注意：保证基因的阅读框架的不能改变。

44 5’ ATGAAATATACAAGTTATATCT …………………….TCGAAGAGCATCCCAGTAA 3’
第一步：扩增IFN-基本序列 IFN- 序列 5’ ATGAAATATACAAGTTATATCT …………………….TCGAAGAGCATCCCAGTAA 3’ 3’ TACTTTATATGTTCAATATAGA………………………..AGCTTCTCGTAGGGTCATT 5’ 变性, 引物复性 gaagagca tcccagtaa 5’ at gaaatataca agt 3’ CTTCTCGTAGGGTCATT 下游(3’ )引物的结合 上游(5’ )引物的结合 atg aaatataca agt 5’ 3’ 特异性序列是否少了点? start codon 5’引物照抄 3’引物互补倒读 5’引物： 5’--ATG AAATATACAAGT－3’ 3’引物：3’--TTA CTGGGATGCTCTTC－3’ stop codon

45 第二步：GC比值；Tm值 5’－GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT－3’ 5’引物： 3’引物:
3’引物：3’--TTA CTGGGATGCTCTTC－3’ GC比值 太多 ----加酶切位点或G,C 5’引物： BamHI 5’－GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT－3’ GC=11 AT=15 3’引物: EcoRI 5’－ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC－3’ GC=12 AT=15

46 第三步：检测引物的发夹结构，二聚体等。 1. 肉眼观察。 2. 利用软件检测，稍后在软件使用中讲解。

47 经过上述三个步骤后，即将获得扩增IFN-gamma全长的引物：
5’引物： 5’－GCAGCGGATCC ATG AAATATACAAGT－3’ 3’引物: 5’－ATCGGAATTC TTA CTGGGATGCTCTTC－3’ 然后可以将序列信息送到生物公司进行合成。 一对引物约30元人民币

48 扩增目的基因的部分序列 1. 引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 一般情况下，在设计RT-PCR引物时， 5’引物和3’引物的距离之间跨越1-2个内含子。 5’ 3’ Extron 1 intron 1 Extron 2 3. 根据PCR产物的长度，选择5’引物和3’引物 的在编码基因中的位置： 常规PCR反应中：PCR产物的长度300bp左右； 实时定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右。

49 Homo sapiens high mobility group box 1 (HMGB1), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_ >gi| |ref|NM_ | Homo sapiens high mobility group box 1 (HMGB1), mRNA TGGAGAGTAATGTTACAGAGCGGAGAGAGTGAGGAGGCTGCGTCTGGCTCCCGCTCTCACAGCCATTGCAGTACATTGAGCTCCATAGAGACAGCGCCGGGGCAAGTGAGAGCCGGACGGGCACTGGGCGACTCTGTGCCTCGCTGAGGAAAAATAACTAAACATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATAAGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGAGTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAGACCATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACAAGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGAAGTTCAAGGATCCCAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTGAGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCGAAGAAACTGGGAGAGATGTGGAATAACACTGCTGCAGATGACAAGCAGCCTTATGAAAAGAAGGCTGCGAAGCTGAAGGAAAAATACGAAAAGGATATTGCTGCATATCGAGCTAAAGGAAAGCCTGATGCAGCAAAAAAGGGAGTTGTCAAGGCTGAAAAAAGCAAGAAAAAGAAGGAAGAGGAGGAAGATGAGGAAGATGAAGAGGATGAGGAGGAGGAGGAAGATGAAGAAGATGAAGATGAAGAAGAAGATGATGATGATGAATAAGTTGGTTCTAGCGCAGTTTTTTTTTTCTTGTCTATAAAGCA 编码区：

50 第一步. 引物的位置最好在cDNA保守区的位置进行设计。
黑色区域显示同源性较高的位置 （bio Edit 软件分析） 当基因有多个mRNA剪接体时： 引物应该选择保守的位置，如 如： 高度变异，引物不能选择这个位置。

51 第二步. 引物的位置最好跨越基因的一个内含子。
外显子的位置： （1-149, , , , …..) 上一步同源性比较的结果 的位置为保守区： 可以选择： 上游引物位置 区间内 下游引物位置 区间内

52 第三步. 根据PCR产物的长度，选择5’引物和3’引物 的在编码基因中的位置：
定量PCR反应中，PCR产物的长度约150bp左右， 选择： 上游引物位置.. 163bp-183bp 下游引物位置 GCATGGGCAAAGGAGATCCTAA TTAGCAGACATGGTCTTCCAC 第四步. 根据引物设计软件对设计的引物进行检查（引物的GC比值，发夹结构，二聚体等）。

53 引物设计软件 PCRDESIGN （分析评价引物的功能，简单方便） Oligo 6.0 （分析评价引物功能，最优秀）
Primer Premier 5.0 （自助搜索引物的功能） -----生物软件网下载

54 PCRDESIGN 软件使用介绍 -----检测引物

55 第一步。PCRDESIGN 软件启动页面，输入A即可开始操作。

56 第二步。编辑-粘贴-输入上游引物与下游引物的序列，按enter 键。
第三步。检测引物的是否有发夹结构（一般小于6个bp）

57 第四步。检测上下游引物之间是否有互补序列，即引物的二聚体 （一般小于6个bp） 。

58 第四步。检测上下游引物之间是否有重复序列（一般小于6个bp） 。

59 第五步。检测上下游引物之间GC比值 。

60 Oligo 6.44 软件使用介绍

61 Oligo 6.44 主要功能：用于引物的检测 Oligo 6.44 启动界面 Open sequence file

62 点击：接受accept. 弹出三个窗口

63 其中一个是：Melting temperature 一般情况下在这个窗口上工作。

64 编辑上游引物，输入上游引物在模板上结合的位置

65 1. 上游引物位置.. 163bp-183bp，与模板结合的位置为163-1的位置，输入162.
2. 上游与模板结合后，序列是完全一致的。

66 1. 下游引物位置.. 307bp-327bp，与模板结合的位置为307的位置.
2. 下游引物与模板结合后，序列是完全一致的。

67 引物分析 1. 检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 2. 发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好
Dimer and cross Dimer 2. 发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好 Hairpin 3. 检查为GC 含量，以45-55％为宜 GC% 4. 检测与PCR其他模板上错配的位置。 Total PCR information

68 下游引物分析结果 1. 引物二聚体分析 2. 引物发夹结构分析 3. 引物GC比值分析 4. 引物在模板上错配概率

69 Primer Premier 5.0使用介绍

70 Primer Premier 5.0使用介绍 主要功能：用于引物的检索 Preimer Premier 启动界面 Load sequence

71 第一步. 输入基因的序列 Choose a function

72 第二步.搜索上下游引物在基因序列中适合的位置。

73 第三步.引物搜索选项设定 引物类型 引物长度 搜索模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围

74 第四步，选择引物搜索的结果 13个引物 每对引物的信息 引物分值 100分为满分 双击选中一对引物

75 是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等
第五步.检测软件设计的引物 是否出现引物自身发夹结构，二聚体，错配位点等

76 上游引物搜索结果

77 下游引物搜索结果

78 第六步，获取引物信息 引物及产物信息

79 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有
…

80 引物设计软件小结 PCRDESIGN （分析评价引物的功能，简单方便） Oligo 6.0 （分析评价引物功能，最优秀）
Primer Premier 5.0 （自助搜索引物的功能） Oligo 6.0与Primer Premier 5.0 搭配使用，可快速设计出成功率高的引物。

81 引物特异性检测 设计PCR引物后，需要对引物的特异性进行检测。 检测引物是否能与基因组或cDNA数据库中其他位置结合，扩增出非特异性条带。
—Primer Blast Primer-BLAST可以直接从Blast主页进入： （ Primer Blast也可以直接用下面的链接进入：

82 提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）
1. 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。 输入验证引物

83 根据需要设置外显子与内含子选项 在specificity check区： 4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome, and nr；多个物种（人，鼠） 。

84 Primer-blast 软件检测结果

85 Primer-blast 软件检测结果 检测结果显示：
HMGB2基因虽然有相似区，但是3’端没有完全互补，因此该引物只能特异性地扩增HMGB1基因，不能扩增出HMGB2基因。

86 下 午

87 序列查找及引物的设计 教师指导下，学生自主读取基因的序列，设计引物（13：30-15：00） 根据不同的实验目的设计引物，比如全长，部分
总结自己所遇到的问题及解决方法，与他人分享

88 测试题1. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha1的部分序列，用于IFN-alpha 1 基因的检测。
Group 1 测试题1. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha1的部分序列，用于IFN-alpha 1 基因的检测。 The mRNA sequence of Homo sapiens interferon, alpha 1 is as followed: 1 agaacctaga gcccaaggtt cagagtcacc catctcagca agcccagaag tatctgcaat 61 atctacgatg gcctcgccct ttgctttact gatggtcctg gtggtgctca gctgcaagtc 121 aagctgctct ctgggctgtg atctccctga gacccacagc ctggataaca ggaggacctt 181 gatgctcctg gcacaaatga gcagaatctc tccttcctcc tgtctgatgg acagacatga 241 ctttggattt ccccaggagg agtttgatgg caaccagttc cagaaggctc cagccatctc 301 tgtcctccat gagctgatcc agcagatctt caacctcttt accacaaaag attcatctgc 361 tgcttgggat gaggacctcc tagacaaatt ctgcaccgaa ctctaccagc agctgaatga 421 cttggaagcc tgtgtgatgc aggaggagag ggtgggagaa actcccctga tgaatgcgga 481 ctccatcttg gctgtgaaga aatacttccg aagaatcact ctctatctga cagagaagaa 541 atacagccct tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatccc tctctttatc 601 aacaaacttg caagaaagat taaggaggaa ggaataacat ctggtccaac atgaaaacaa 661 ttcttattga ctcatacacc aggtcacgct ttcatgaatt ctgtcatttc aaagactctc 721 acccctgcta taactatgac catgctgata aactgattta tctatttaaa tatttattta 781 actattcata agatttaaat tatttttgtt catataacgt catgtgcacc tttacactgt 841 ggttagtgta ataaaacatg ttccttatat ttactc

89 测试题2. 请设计一对引物，扩增IL-4的部分序列，用于IL-4基因的检测。
Group 2 测试题2. 请设计一对引物，扩增IL-4的部分序列，用于IL-4基因的检测。 The mRNA sequence of Homo sapiens interleukin 4 is as followed: 1 ttctatgcaa agcaaaaagc cagcagcagc cccaagctga taagattaat ctaaagagca 61 aattatggtg taatttccta tgctgaaact ttgtagttaa ttttttaaaa aggtttcatt 121 ttcctattgg tctgatttca caggaacatt ttacctgttt gtgaggcatt ttttctcctg 181 gaagagaggt gctgattggc cccaagtgac tgacaatctg gtgtaacgaa aatttccaat 241 gtaaactcat tttccctcgg tttcagcaat tttaaatcta tatatagaga tatctttgtc 301 agcattgcat cgttagcttc tcctgataaa ctaattgcct cacattgtca ctgcaaatcg 361 acacctatta atgggtctca cctcccaact gcttccccct ctgttcttcc tgctagcatg 421 tgccggcaac tttgtccacg gacacaagtg cgatatcacc ttacaggaga tcatcaaaac 481 tttgaacagc ctcacagagc agaagaacac aactgagaag gaaaccttct gcagggctgc 541 gactgtgctc cggcagttct acagccacca tgagaaggac actcgctgcc tgggtgcgac 601 tgcacagcag ttccacaggc acaagcagct gatccgattc ctgaaacggc tcgacaggaa 661 cctctggggc ctggcgggct tgaattcctg tcctgtgaag gaagccaacc agagtacgtt 721 ggaaaacttc ttggaaaggc taaagacgat catgagagag aaatattcaa agtgttcgag 781 ctgaatattt taatttatga gtttttgata gctttatttt ttaagtattt atatatttat 841 aactcatcat aaaataaagt atatatagaa tct

90 测试题3. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha 5的部分序列，用于IFN-alpha 5基因的检测。
Group 3 测试题3. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha 5的部分序列，用于IFN-alpha 5基因的检测。 The mRNA sequence of Homo sapiens interferon, alpha 5 is as followed: 1 gcccaaggtt cagggtcact caatctcaac agcccagaag catctgcaac ctccccaatg 61 gccttgccct ttgttttact gatggccctg gtggtgctca actgcaagtc aatctgttct 121 ctgggctgtg atctgcctca gacccacagc ctgagtaaca ggaggacttt gatgataatg 181 gcacaaatgg gaagaatctc tcctttctcc tgcctgaagg acagacatga ctttggattt 241 cctcaggagg agtttgatgg caaccagttc cagaaggctc aagccatctc tgtcctccat 301 gagatgatcc agcagacctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tacttgggat 361 gagacacttc tagacaaatt ctacactgaa ctttaccagc agctgaatga cctggaagcc 421 tgtatgatgc aggaggttgg agtggaagac actcctctga tgaatgtgga ctctatcctg 481 actgtgagaa aatactttca aagaatcacc ctctatctga cagagaagaa atacagccct 541 tgtgcatggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatcct tctctttatc agcaaacttg 601 caagaaagat taaggaggaa ggaatgaaaa ctggttcaac atcgaaatga ttctcattga 661 ctagtacacc atttcacact tcttgagttc tgccgtttca

91 测试题4. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha 6的全长，需要表达IFN-alpha 6蛋白质。
Group 4 测试题4. 请设计一对引物，扩增IFN-alpha 6的全长，需要表达IFN-alpha 6蛋白质。 The mRNA sequence of Homo sapiens interferon, alpha 6 is as followed: 1 atggctttgc cttttgcttt actgatggcc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 61 tctctggact gtgatctgcc tcagacccac agcctgggtc acaggaggac catgatgctc 121 ctggcacaaa tgaggagaat ctctcttttc tcctgtctga aggacagaca tgacttcaga 181 tttccccagg aggagtttga tggcaaccag ttccagaagg ctgaagccat ctctgtcctc 241 catgaggtga ttcagcagac cttcaacctc ttcagcacaa aggactcatc tgttgcttgg 301 gatgagaggc ttctagacaa actctatact gaactttacc agcagctgaa tgacctggaa 361 gcctgtgtga tgcaggaggt gtgggtggga gggactcccc tgatgaatga ggactccatc 421 ctggctgtga gaaaatactt ccaaagaatc actctctacc tgacagagaa aaagtacagc 481 ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccttctcttc atcaagaaac 541 ttgcaagaaa ggttaaggag gaaggaataa 引物两端需要加入酶切位点 EcoRⅠ和 HindⅢ. EcoR I GAATTC Hind Ⅲ AAGCTT

92 That’s all for today Thank you