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血液学一般检验：概论 医学检验系临检教研室 陈丽华
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补充：绪言
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一、临床检验的历史和现状
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Physician studying urine, with four patients(15th)
古代:感官检查 （如：尿液－中世纪）
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尿轮(urine wheel)的发明;
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17世纪:荷兰Leeuwenhoek发明显微镜
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20世纪末以来:自然科学基础学科与医学基础学科结合－电脑化、自动化、微量化
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21世纪：现代信息网络技术（远程诊断）与系统生物工程（包括分子生物学）、临床医学结合。
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最常用的临床检验，借助先进的检测技术，对来自离体的血液、尿液、粪便以及分泌物和排泄物等标本进行理学、化学、病原学和显微镜形态学的检查，以简便、快速的检测结果，基本满足临床医学检验筛检疾病的需求。
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本课程的特点 项目多联系少 理解易记忆难 实践操作是关键 基础实用须重视
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二、临床检验特点 1. 已进入仪器检验的时代 （1）速度快 （4）参数多 （2）精度高 （5）易质控 （3）操作易 （6）信息大
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分析前 2.需要实施全程质量保证 分析中 分析后 3.需要合格的检验人员和标准化的检验方法 4.现代仪器检验更强调生物安全。
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三、临床检验基础教学目的 1.为疾病诊断和鉴别诊断提供实验室检查客观依据 例：anemia 依据：血中红细胞和血红蛋白量减少
leukemia 依据：血象和骨髓象 肾脏有实质性损伤的依据 尿液中出现蛋白、细胞管型
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2.为分析病情、观察疗效、判断预后提供依据 在疾病过程中，血液、体液、分泌物和排泄物也 会随之发生相应的变化 3.为预防疾病提供资料 如血象和肿瘤细胞学的普查等 4.为科学研究提供医学检验基本数据、基本检验方法和操作技能。
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四、临床检验的一般方法 1、目视检查 直接观察标本：颜色、透明度、性状，有无 凝块或寄生虫 2、理学检查
液体的相对密度、血液粘度、红细胞沉降 率、红细胞比积等病理变化 3、化学检查 定性和定量检测标本化学成分的病理变化 观察有型成分的数量和形态 4、显微镜检查 5、自动化仪器检查 电子技术、程序控制的发展
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五、学好临床检验基础基本要求 1.掌握检验的基础理论； 2.掌握检验的基本技能； 3.熟悉检验方法学的评价； 4.了解检验项目的参考值；
5.熟悉检验项目的临床意义，用循证检验医学的新思维指导临床检验。
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六、注意事项 1.在运用实验结果协助诊断疾病时，必须结合临床进行全面分析，动态观察, 其理由:
2.当实验结果与临床不符合时，则更应重视临床并进行动态观察。
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第一章第一节：概论
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目的要求 1、掌握：毛细血管采血；抗凝剂的种类及选择；血涂片制作、瑞氏染色的原理、方法、质量控制和方法学评价 2、熟悉：静脉采血、真空采血
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重点： 1、掌握毛细血管采血 2、掌握血片的制备及染色 难点: 1、抗凝原理及抗凝剂的选择 2、静脉采血
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血液学一般检验的用途 1.协助诊断及鉴别诊断； 2.病情观察和预后判断； 3.某些治疗的监护； 4.术前准备；
5.协助传染病和职业病的调查。
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一、血液生理概要
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1.血液的组成 红细胞 白细胞：N,E,B,L,M 血细胞（45%） 血小板 血液 固体成分（8%~9%）：血浆蛋白、无机盐、脂类等
血浆（55%） 红细胞 白细胞：N,E,B,L,M 血小板 固体成分（8%~9%）：血浆蛋白、无机盐、脂类等 水（91%~92%）
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血浆与血清 血浆:血液加抗凝剂后分离出来的淡黄色液体称为血浆； 血清：离体后的血液自然凝固后，分离出来的淡黄色透明液体称为血清。
血清与血浆比缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。
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2.血液主要的理化性质 （1）血量：70±10ml/kg体重，成人约4~5升，约占体重的6%~8%。
（2）颜色:来自于Hb。动脉血鲜红色，静脉血暗红色。 （3）红细胞在血浆中的悬浮稳定性：Zeta电位
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（4）粘滞性：主要取决于血细胞比容和血浆粘度。健康成人的全血粘度为N.S.粘度的4~5倍，血浆粘度为N.S.粘度的1.6倍左右。
（5）比重和渗透浓度： 比重 男性：1.055~1.063，女性：1.051~1.060. 渗透压：290~310mOsm/kg·H2O
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（6）pH：7.35~7.45，动脉血pH值7.40，静脉血pH值7.35。
（7）凝固性：由于凝血因子被激活，血液离体后会自行凝固。
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3.血液的功能 （1）运输功能：为血液的基本功能。 （2）协调功能：激素、酶类 （3）维护机体内环境稳定
（4）防御功能：白细胞、抗体、补体、细胞因子具有免疫功能；血小板、凝血因子起止血和凝血作用。
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二、血液标本采集
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（一）标本采集的一般要求 1.检验申请单； 2.标本采集和处理具体要求； 3.标本信息完整性； 4.标本拒收。
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（二）血液标本类型 1.全血 静脉全血 动脉全血 毛细血管全血 3.血清：与血浆比较，缺乏纤维蛋白原。 2.血浆 4.分离或浓缩的血细胞成分
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图1 血液标本类型
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（三）血液标本采集方法 皮肤采血 静脉采血 1.按采集部位分 动脉采血 普通采血法 2.按采血方式分 真空采血法
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一）皮肤采血法（毛细血管采血法） 1.采血部位：一般采用手指（中指或无名指尖内侧）或耳垂，婴幼儿可用拇指或足跟，特殊人员视情况而定。
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2.器材：1）微量吸管：以下两种任选一种 ①Hb吸管； ②一次性毛细玻管 2）消毒用品：75%乙醇棉球、干棉球 3）一次性采血针
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3.采血方法：按摩 消毒，干燥 进针 弃第一滴血 吸取血液 止血
4. 注意事项：①生物安全，挤压力度（约3mm深） ②动作要快。 ③多项检查时，采集标本顺序为：Plt、 RBC、 Hb、 WBC、 DC。
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二）静脉采血法 1.普通采血法 （1）器材准备：试管、注射器、消毒器材
（2）采血部位：主要是肘静脉。还可以在：手背部手腕部等。幼儿可采用颈外静脉采血。
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（3）操作：扎压脉带 消毒，进针 ，松压脉带 抽血 按压，拔针 继续按压数分钟
（4）注意事项： ①若病人晕针，应立即拔出针头，让病人平卧，必要 时可给病人嗅吸芳香酊或针刺人中和合谷穴位，或给 予糖水口服。
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②防止标本溶血：容器清洁、干燥；轻轻推注血液；压脉时间不宜太长，抽血速度不宜太快；与抗凝剂混匀时不宜用力振荡；离心速度不宜太快。
③以空腹采血为主。 ④出血性疾病要用硅化或塑料胶管。
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⑤切忌将注射器内气泡推回血管。 ⑥应注意无菌操作。 2.真空采血法
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两种采血方法的区别 毛细管采血法 静脉采血法 采血部位 手指、足跟 肘部静脉（浅表静脉均可） 采血器材 专用采血针 注射器，真空采血器
毛细管采血法 静脉采血法 采血部位 手指、足跟 肘部静脉（浅表静脉均可） 采血器材 专用采血针 注射器，真空采血器 采血量 少，<0.1ml 多，>0.2ml 适用范围 需血量少的项目 需血量多（或）少的项目 注：两种方法结果有不同程度的差异。如静脉血小板数>毛细管血。
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两种采血方法的优缺点比较 毛细血管血 静脉血 限制了重复实验和追 加实验，标本量少， 局部炎症可得假结果 ，组织液可混入 不同抗凝剂的使用，
改变血液性质，影响 有形成分的形态 缺点 标本代表性大，无组 织液影响，适于临床 研究，可重复实验和 追加其他实验 优点 价廉、快速、操作简 便，标本可直接测定
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三）动脉采血法 1.器材准备：注射器、肝素生理盐水溶液、橡皮塞、消毒器材等。 2.选择动脉：多选用桡动脉、股动脉、肱动脉。 3.采血步骤
4.注意事项：①避免空气； ②立即送检；③防止血肿。
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动脉采血法：血液气体分析 ( vacuum tube for blood collection) 部位：深部动脉如股动脉、桡动脉等。
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三、血液标本抗凝
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抗凝：应用物理的或化学的方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子的活性，阻止血液凝固，称抗凝。
抗凝剂（物质）：能够阻止血液凝固的化学试剂或物质。
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1.枸橼酸钠（trisodium citrate）
又名柠檬酸钠；化学名：3-羟基-3-羧基戊二酸（三钠盐） a. 抗凝原理：螯合钙离子 使用方法 配成109 mmol/L的浓度和血液1：9 106 mmol/L的浓度和血液1：4 c. 适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）
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2.乙二胺四乙酸（EDTA）盐 a. 抗凝原理： 螯合钙离子 b. 使用方法： 15g/L浓度EDTA 和血液 1：10
适用范围： 对血细胞形态影响小---血小板计数； 影响血小板聚集和白细胞吞噬功能 ---不宜做止血学检验及血小板功能 检验。
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3. 草酸盐（sodium oxalate） a. 抗凝原理：草酸钙沉淀 b. 使用方法 草酸钠0.1mol/L 和血液1：9
c. 适用范围： 止血学检验；逐步被淘汰。
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4. 双草酸盐抗凝剂 a. 抗凝原理： 草酸钙沉淀 使用方法： 草酸钾0.8g , 草酸铵1.2g（100ml）
4. 双草酸盐抗凝剂 a. 抗凝原理： 草酸钙沉淀 使用方法： 草酸钾0.8g , 草酸铵1.2g（100ml） 与血液 1：10 （80°C以下烘干） 适用范围： 红细胞检验（红细胞比积、计数） 不适于血小板计数和白细胞分类计数
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5. 肝素(heparin） 抗凝原理：加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成和抑制血小板聚集。
b. 适用方法： 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10
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优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。
适用范围： 红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白 测定、红细胞比积）和多种生化分析。但不适用于白细胞计数和分类计数。
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6. 促凝剂 a. 抗凝原理：激活凝血蛋白酶，加速血液凝固。 b.适用项目：缩短血清分离时间，特别适用于急 诊化学检验。
常用促凝剂：凝血酶、蛇毒、硅石粉、硅碳素等。
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7. 分离胶 抗凝原理：高粘度凝胶在血清和血块间形成隔层， 达到分离血细胞和血清的目的。 适用项目：能快速分离出清晰的血清标本，
有利于标本的冷藏保存。 注意事项：分离胶质量影响分离效果和检验结果；分离胶试管成本高。
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物理方法抗凝 脱纤维蛋白： 将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，从而防止血成凝块。适用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查及血液培养基的羊血采集。也可用竹签搅拌除去纤维蛋白。
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四、血涂片制备
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1.血涂片的用途： 血细胞形态学检验、网织红、异常寄生虫检验。
2.载玻片要求：清洁、干燥、中性、无油腻 新购置载玻片处理：1mol/L HCl浸泡24h后再彻底清洗； 用过的载玻片：肥皂水煮沸20min，洗掉血膜再用清水清洗干净。
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3.血涂片制备方法 （1）手工推片法 将推玻片向1的方向稍抽回，当血液快充满载片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。
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良好血涂片标准：头、体、尾分明，厚薄适宜，边缘整齐，两侧留有空隙。
注意：涂片的厚薄与血滴的大小、推片与载片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。 血滴大，速度快、角度大----血膜厚 （）
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（2）载（盖）玻片压拉法：用于血细胞的活体染色。
（3）棕黄层涂片法：离心取红细胞层上的棕黄层涂片。适用于白细胞减低患者的白细胞分类计数及红斑狼疮细胞检查。 （4）仪器自动涂片法 （）
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五、血细胞常用的染色方法 常用染方法有:瑞氏染色法;瑞姬氏染色法； 姬姆萨氏染色法;
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（一） 瑞氏染色法 1.染色原理 （1）染料组成：由酸性染料伊红（E）和碱性染料亚甲蓝（M）溶解于甲醇而成。
（2）瑞氏粉的性质：是一种复合染料 ME M+ + E- 甲醇
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（3）甲醇的作用：溶解美蓝和伊红；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。
（4）细胞对染液的反应 ：取决于其化学性质，既有物理的吸附，又有化学的亲和作用。 （5）pH对染色的影响：酸性环境中，涂片偏红；碱性环境中，涂片偏碱。 因此染色以pH6.4~6.8为宜。
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2.试剂 （1）瑞氏染液：瑞氏粉1g，甲醇600mL，甘油15mL。
（2）磷酸盐缓冲液（PBS）：磷酸二氢钾（无水）0.3 g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。
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3.染色方法 a. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。 b. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。
c. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。 d. 用清水冲洗，待干后镜检。
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4.染色结果判断 1）正常：外观呈淡紫红色； 镜下红细胞染粉红色，白细胞胞质中颗粒清楚。 2）偏酸：涂片偏红， 核难着色 3）偏碱：染色偏蓝
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5.瑞氏染液的质量评价 （1）采用吸光度比值（RA）为评价指标。瑞氏染液的成熟指数以RA（A650nm/A525nm）=1.3±0.1为宜.
（2）染液的成熟过程主要是美蓝逐渐转变为天青B的过程。在密封条件下，贮存时间愈久，转化的天青B愈多，染色效果愈好。
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6.注意事项 a. 血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落 b. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关， 一般染液淡、染色时间长些效果好。
c. 染液不能过少，以防蒸发沉淀。
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d. 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。
e. 染色过淡，可复染。 f. 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。
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（二）姬姆萨染色法 一）、染色原理： 基本成分仍然是伊红和亚甲蓝，改进了染料的质量，使细胞核和寄生虫着色好，结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒染色较差。 二）、试剂 Giemsa 甲醇 纯甘油 三）、染色方法 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检
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（三）方法学评价 1.瑞氏染色法是血细胞分析最常用的染色方法。尤其对于细胞质成分及中性颗粒等的染色效果较好，但对核的染色不如吉姆萨染液。
2.用瑞-吉姆萨复合染液可取长补短，获得满意效果。
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