法医病理学 组织切片制作.

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1 法医病理学 组织切片制作

2 HE染色切片

3 一、目的要求 掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋，切片制作。 （一）取材 1.取材快，新鲜，防止组织腐败。
一、目的要求  掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋，切片制作。 （一）取材 1.取材快，新鲜，防止组织腐败。 2.取材刀锋利，垂直地切取，严禁挤压或用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。 3.取材大小，lcm～3cm×1cm～2cm×0.3cm～0.5cm。材料过大在短时间内不易固定透，影响效果。

4 （二）方法： 1. 实质器官 心脏：心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常组织。可单独取心室肌，乳头肌，3～5块。 肺脏：左右两肺（五个肺叶）；可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在不同肺叶上取材，可用形状做标志在记录时记清楚，5～7块。 肾脏：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，应区别左右肾，2～4块。 胰腺：取胰体部，必要时加取胰头、胰尾，2块。 肝脏：取长方形或三角形，2～3块。 脾脏：取材带被膜，2～3块。

5 脑：全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈段及脉络丛，十一块，或根据具体情况决定：
①额极；②前后中央回；③海马；④内囊；⑤丘脑；⑥枕叶；⑦脉络丛；⑧桥脑；⑨延髓；⑩中脑； ⑪小脑。取材时要带上软脑膜、脑室膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时取脊髓。 垂体：前、中、后叶和垂体柄，从前向后横切。

6 2．管腔脏器： 取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。 大肠、小肠：应考虑环行皱襞，沿肠管的长轴取（纵切）。 食管、气管：横切面为宜。
胃：常规取胃底。 取材后应将被膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，防止或减少组织受压变形与收缩。 有病变的部位，应附带周围正常组织取材。

7 二、固定 （一）意义：是做好切片的重要步骤之一，如果首次组织固定不良，再重新固定效果不佳。
检材固定的关键：取材后尽可能地及时地将所取的材料进行固定，以防止其“死后”变化的进展，尽力使组织接近于生前状态。为了防止组织结构及成份的破坏和溶解消失，需要使其转变为不溶性物质，有利于组织结构保存--固定的基本意义。

8 固定的目的： 1. 阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。 2．保存组织的结构及成份。 3．媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同 亲和力，使细胞各部易于受色。 4．能使组织硬化，为制作薄切片奠定基础。 注意：材料块不能过大，固定器皿不易过小，固定液量不易过少，应是固定材料体积的20一30倍。

9 固定液分类：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液（或复合），由二种以上的药剂组成。
（二）固定液： 根据检验目的不同选择不同种类固定液，如糖原检查：不含水的固定液；电镜检查：锇酸固定液等；HE染色：甲醛。 固定液：用以固定组织的药剂。 固定液分类：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液（或复合），由二种以上的药剂组成。 1．选择固定液的标准： ①具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构保持生活状态。 ②不使组织过度收缩与膨胀而变形。 ③能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。 ④使组织达到一定的硬度便于切片制作。 ⑤价格便宜，易购买，配制方便。

10 2．单纯固定液 乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸 （1）乙醇（酒精）（alcohol） 优点： ①价格低，易购买，易溶于水，使用方便，95％浓度，无水乙醇100％； ②市售有两种：100%；95%； ③能硬化组织起固定作用； ④也是一种最常用的脱水剂。 固定用浓度在70％～80％，酒精浓度愈大组织收缩愈严重，浓度过低起不到固定作用。 缺点： ①穿透力小，由于被固定的组织表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，所以用乙醇固定的组织材料要小。 ②使组织严重收缩。 ③由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，使细胞核核色不佳。。 ④溶解脂肪、血红蛋白和多种色素，脂肪染色必须制作冰冻切片。

11 2．甲醛：（福尔马林）（formalin）
最常用的固定液，一种还原剂，无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体，不能与氧化剂混使用。可应用于组织学、组织化学、免疫组织化学等染色，最好用时现配。 商品甲醛：37％～40％甲醛水溶液。 固定液的浓度：4％～8％（习惯上称为10％或20％的福尔马林）。 固定时间：常温下固定24h～48h。快速固定，可加温到70℃～80℃或者加温煮沸10min即可。快速固定，组织块不宜过厚或过大，缺点是组织收缩较严重。 固定液配制：甲醛1份与9份自来水混合即为10％（4%）浓度的甲醛固定液。

12 优点：①渗透力较强；②组织收缩小；③细胞核染色较好。
缺点： ①质量较差的formalin在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物称“三聚甲醛”（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性，影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁，简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。 ②酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物，称为福尔马林色素，在切片上形成黑色小颗粒，不溶于水和酒精，影响染色效果和切片的观察。

13 去掉福尔马林色素颗粒方法： ① Schridde法 25％氨水 l ml 75％酒精 ml 切片脱蜡经70％酒精时，用上液浸泡半小时或稍长一些时间，然后水洗再行染色。 ②Verocay法 l％氢氧化钾水溶液 l ml 70％酒精 ml 切片脱蜡经酒精80％时入上液处理10分钟，经70％酒精入水后即可染色。

14 （三）水洗 1.用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。 2.水洗时间数小时至24小时。 3.根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗 筐或用纱布包裹，防止水流过大将组织块冲掉或丢失。 (四)脱水 组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须制成石蜡组织块，脱水是继固定后的重要步骤。   经固定和水洗后的组织含大量水分，在这种情况下首先必须除去组织内部的水分，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱水剂。 脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒，否则引起组织强烈收缩，变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸进石蜡。

15 常用脱水剂：溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇等。
（1）酒精 步骤：70％ 80％ 90％ 95％ ％Ⅰ 100％Ⅱ，一般数小时到12小时，更换一次酒精。 配低浓度酒精时，可用市售95％酒精配制。70％酒精：95％酒精70ml加蒸馏水25ml至95ml；80％酒精：95％酒精80ml加蒸馏水至95ml，依次类推。 （2）丙酮 脱水作用与酒精相似，虽其脱水作用比酒精强，但可引起组织块的收缩较，价钱较贵，故不宜用于一般组织脱水，它即有脱水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脱水1～8小时即可。

16 （五）透明 目的：因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒介作用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明，用于透明的试剂称为透明剂。 透明时间：根据组织块的大小而定，一般20分钟至1小时。组织块过大可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉呈透明状。 透明剂：二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。最常用二甲苯。 二甲苯：无色透明有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触对粘膜有刺激作用，透明作用很强，可使组织收缩变形，透明时间不宜过长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时说明脱水不彻底，如果造成透明不彻底应退回到100％酒精中重新透明。

17 六、浸蜡与包理： 浸蜡的目的：为了能制作薄切片做准备，将透明好的组织块浸到融化的石蜡中，使石蜡渗透到组织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，再用石蜡将组织包埋，冷却后，切成小块，修整好切面，这一过程为浸蜡与包埋。

18 具体操作： （一）浸蜡 石蜡箱温度58℃～60℃左右，内有标明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的蜡杯或蜡缸，从透明的二甲苯Ⅱ取出组织块，放入Ⅰ号蜡杯中2h～3h，再将组织块移入Ⅱ号蜡杯（纯蜡）2h～4h，再移入Ⅲ号蜡杯中（纯蜡）半天或者稍降蜡箱温度过夜，最后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。 注意：浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用，以免脱二甲苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关闭蜡箱，需要时再开。温度越高，时间越长组织块收缩越严重，而且材料脆而不易制作切片。

19 （二）包埋： 包埋方法：石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法、环氧树脂包埋法（电镜用）等。 步骤：纯石蜡溶解后（60℃）倒入包埋框内或纸盒内，迅速将浸好的组织块的切面向下、放平，依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后，将组织材料凝结在石蜡内。然后按组织块大小切成蜡块，组织四周蜡边留0.1厘米左右即可。 注意：如果操作不熟练或在冬天包埋时最好用酒精灯。在材料包入石蜡之前，稍在酒精灯上过一下加温，以免材料与包埋蜡温度不符造成材料与包埋蜡间遗留缝隙，切片时产生分离现象。 蜡块背面要标记例号等字样的纸片，以长期保存。切完的蜡块表面要用烫片板，烫一下封闭材料面，隔离空气接触可长期保存材料不干。

20 （三）蜡的种类： 1．蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称为黄蜡，溶点在54℃左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。 2．石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡。 软蜡：50℃以下的石蜡。硬蜡：溶点在50℃以上的石蜡。两种蜡可以混合在一起使用。石蜡熔点有52℃～54℃，56℃～58℃，58℃～60℃，60℃～62℃。

21 七、切片 工具：切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载薄片、手术刀、毛笔、弯镊子、托盘、大平皿（展片使用）、烤片盒、蛋白甘油等。 （一）切片机种类：轮转式切片机、滑行式切片机（滑动式）、冰冻切片机、超薄切片机等（电镜用）。 （二）构造：由四个基本部分组成：刀台、标本台、旋转轮、控制切片厚度的微动装置（标有 l～25或1～50的数字，每一数字代表一个微米）。根据需要调节厚度，一般采用5μm～7μm。 蛋白甘油：用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚。

22 （三）切片制作 1．将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。 2．将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露出来修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。 3．蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝同时调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。 4．调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 5μm～7μm）。 5．修材。右手握旋转轮摇把按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整暴露为止。

23 （四）展片 水浴锅上平皿内水温升至45℃左右，将已切好的连续薄片切分成数片，放在水面，轻漂，水中展平，未展平时可用小弯镊子轻轻展开，然后用涂有蛋白甘油的载片在水中选择完整的切片进行捞片。 （五）注意事项 1．切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至不能制成切片。 2．展切片时水温要适当，水温低，展不平切片，切片有皱折，影响效果；如果水温过高，切片入水后可发生溶化。

24 实习四　法医病理学 组织切片染色

25 目的要求：掌握切片染色、封片等技术及操作过程。
一、染色前准备工作 1．染色：准备的工具：染色缸或者12个盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯染色缸，盖片，带磨口盖树胶瓶一个，镊子1把。 2．染色需要的试剂及染色液的配制： ① 0.5％～1％盐酸—酒精：用于细胞核染色分色。 配制：100ml的70％～80％酒精中加人0.5ml或者1ml的浓盐酸。 ② 苏木素（hematoxylin）及伊红（eosin） 苏木素：细胞核的染料，氧化后的苏木素具有染色能力的。苏木素的配方：二种，一是自然氧化的苏木素；二是加入氧化剂加速氧化的。

26 3．苏木素的配方 ①自然氧化（Ehrlieh）苏木素： 苏木精 g 铵明矾 g 无水酒精 ml 甘油 ml 蒸馏水 ml 将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，瓶口罩上数层纱布以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然氧化（成熟过程），约6周—8周以上，染液配制越久其染色能力越强，可以一次大量配制以备用。

27 ② 自然氧化（Delafield）苏木素：
苏木素 g 无水酒精 ml 铵明矾饱和水溶液 ml 铵明矾饱和水溶液配法：10％铵明矾水溶液，或1份铵明矾加蒸馏水11份。 配制过程：苏木素溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻璃瓶中敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处3 ～ 5天后过滤，再加入甘油100ml、甲醇100ml。置光线充足处经l.5～2个月后成熟。染液可保存多年，染色时多采用蒸馏水稀释的染色液。

28 ③ 加氧化剂的苏木素配制 Harris苏木素： ① 液 苏木精 l g 无水酒精 ml ② 液 钾（铵）明矾 g 蒸馏水 ml ③ 氧化汞 g ④ 冰醋酸 ml 配制方法：先将①液用玻璃棒搅拌使苏木素溶解，再将②液煮沸溶化去火，速加入①液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化汞0.5g，再煮沸，迅速冷却后加入冰醋酸8ml过滤使用，组织学常用染色液。

29 4．伊红（eosin） 最常用的细胞质染料之一，外观为红色粉末。分两种：酒溶性伊红；水溶性伊红。 配法：①0.5％水溶性伊红 伊红0.5g+蒸馏水100ml，溶解后使用。 ②0.5％酒精溶性伊红 伊红0.5g+70％酒精100ml，溶解后使用。 一般病理组织学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故一般称这种染色法为HE染色（苏木素—伊红染色法）。

30 二、染色方法及步骤 1. 脱蜡：二甲苯Ⅰ10min～20min；二甲苯Ⅱ10min～ 20min。
5．水洗（水洗一下将浮在表面的染液去掉）。 6．分化：l％盐酸酒精分化时间数秒钟，观察切片组织材料呈粉红色。 7．水洗：水道流水洗0.5～数小时，切片从粉红色转变为鲜艳的蓝色（蓝化过程）。 8．染细胞质：0.5％或l％伊红溶液复染1min～5min。 9．脱水：切片脱水由低浓度酒到高浓度酒精。将切片入70％酒精→80％→90％→95％。切片在酒精内几秒钟，时间长，伊红易脱色。应注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。 10. 脱水：100％酒精Ⅰ5min～10min；100％Ⅱ酒精 5min～10min 11. 透明：入二甲苯Ⅰ2min～5min；二甲苯Ⅱ2min～5min。

31 三、封片与染色结果 用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成鲜艳的蓝色，细胞质核仁、肌纤维、胶原纤维、红细胞等呈红色。 HE染色简化程序：（脱蜡、水化）二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水酒精Ⅰ→无水酒精Ⅱ→95％→90％→80％→70％→水洗→苏木素染色（染细胞核）（10min～20min）→自来水洗一下→1％盐酸酒精分化→自来水洗（核分化）→伊红染色（染细胞质）→直接脱水70％→80％→90％→95％（各稍停片刻）→100％Ⅰ→100％Ⅱ（彻底脱水） →透明，二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，中性树胶封片。

32 常规涂片染色的操作方法： 基本与石蜡切片染色程序一样。 不同点：固定液不同，操作时间短。 步骤：涂片自然干燥或加温干燥后甲醇固定，待固定液干燥后，苏木素染色2min～5min→水洗一下去浮色→1％盐酸酒精分化（浸1～2次）→流水洗切片（5min以上）。 伊红染色2min～5min→脱水：70％酒精→80％→90％→95％各数秒，100％Ⅰ～100％Ⅱ各稍停片刻（彻底脱水）→透明：二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，中性树胶封片。

33 四、两种常用的特殊染色方法 （一）Mallory染色 配方： 酸性复红 克 苯胺兰 克 桔黄G 克 磷钼酸 克 蒸馏水 ml

34 染色方法： 1．石蜡切片常规脱蜡至水。 2．入3％重铬酸钾媒染12h～24h，如果固定的材料含升汞可省此步骤，但需脱汞。 3．蒸馏水洗二次。 4．入Mallory染色液中染5min。 5. 蒸馏水洗。 6．95％酒精分化约3min～5min，显微镜下控制染色程度。 7．100％Ⅰ、100％Ⅱ酒精脱水。 8．二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明。 9．树胶封片。 结果：胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，肌组织呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。

35 Contused myocardial fibers stained by Mallory’s trichrome method

36 （二）Weigert染色（弹力纤维染色法）
配方： 盐基品红 g 间苯二酚 g 蒸 馏 水 ml 配制方法：将上述药品一起放入烧杯内，加热煮沸，再加29％FeCl3水溶液25ml，用玻璃棒搅匀，继续煮沸2min～5min，冷却后过滤。倾去滤液不用，将滤纸及沉淀物一同放入烧杯内，放在干燥箱内烘干，取出加 95％酒精200ml，加水煮至沉淀物溶尽，拿出滤纸冷却后过滤并补足蒸发失去的酒精，最后加入浓盐酸4ml即可，此液可保留数月。

37 染色方法： 1．切片脱蜡至酒精。 2．Weigert氏液染色20min～60min。 3．用95％酒精洗去剩余染液，在显微镜下观察结构细节，不清晰时可用1％盐酸酒精分化。 4．自来水洗。 5．以l％中性红做对比染色或用明矾苏木素染后，再用稀释伊红或用Van Gieson液染色。 6．用95％酒精分化，无水酒精脱水。 7．二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明。 8．树胶封片。 结果：弹力纤维显示兰黑色。用中性红做对比染色，肌组织 呈红色。

38 Elastic fibers

39 Collagen and elastic system in the remodelling process of major types of idiopathic interstitial pneumonias (IIP) Histopathology 2005, 46, 413–421