动物组织石蜡切片制作 科研仪器管理中心.

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1 动物组织石蜡切片制作 科研仪器管理中心

2 实验目的 制作实验动物的组织切片并染色，掌握动物组织制片技术

3 实验用品 1．动物的组织。 2．器材和仪器：切片机、展片仪、毛笔、载玻片、盖玻片、烤箱、显微镜。
3．试剂：60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、石蜡、中性树胶。

4 方案一:病理石蜡切片的制作 （一）石蜡组织块制作 1．取材。 2．固定。 3．脱水、透明及浸蜡（具体步骤见表）。 4．包埋

5 步 骤  操作项目  小 鼠  大 鼠  家 兔 （1） 60%乙醇 15min 20min 30min （2） 70%乙醇 （3） 80%乙醇 40min （4） 90%乙醇 （5） 95%乙醇Ⅰ （6） 95%乙醇Ⅱ （7） 无水乙醇Ⅰ （8） 无水乙醇Ⅱ （9）  二甲苯Ⅰ  5min  8min 10min （10）  二甲苯Ⅱ  3min （11）   石蜡Ⅰ （12）   石蜡Ⅱ 25min （13）   石蜡Ⅲ

6 注意事项 一般实质性脏器的组织及肿瘤组织应把最大切面朝下包埋；食管、胃、肠等组织须将管壁横断面朝下包埋，若在同一蜡块中包埋数块管壁组织时，应平行横埋且黏膜面（内膜）的方向应一致，以便切片及观察。 △同一蜡块包埋多个组织块时，组织的性质应相同，方向要一致，不能把大小、厚薄差别悬殊的组织包埋在一起，组织块间的距离不能太大。 △皮肤、骨等难切组织及需要连续切片的组织都应单独包埋。 △神经、脊髓及需要定向包埋的组织应注意组织块的相互关系。 △包埋（尤其在室温较低的情况下）操作应迅速，防止组织块变凉、蜡液凝结及出现气泡，组织块与蜡液不能很好凝固定在一起，导致组织与蜡分离。 △遇有管腔或空洞标本与小标本同埋一个蜡块时，不能将小标本放入其他标本的管腔或空洞内。

7 （二）石蜡切片制作 用切片机将石蜡包埋的组织块（蜡块）制成适宜厚度的切片，是目前在病理学科中最常用的一种制片方法。切片厚度为一般4~6μm。 【切片前的准备】 1、修切蜡块  切片前应先修块，即切去组织周围过多的石蜡，一般留下约2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。 2、切片用品准备 （1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一次性切片。 （2）载物片：载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 （3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度。 （4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。

8 【切片制作过程】 以使用旋转式切片机石蜡切片为例： 1．将切片刀装在刀架上，后将蜡块装在切片机固定装置上。调整蜡块与刀至合适位置（刀刃与蜡块切面呈5°夹角）旋转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端（如皮肤组织，应将表皮部分向上。而胃肠等组织，应将浆膜面朝上）。 2．左手执手笔，右手旋转切片机旋转轮。先粗切标本，直到暴露出组织最大切面（但对小标本不要修切得太多，以免将整个组织块修切掉）。再连续旋转切出蜡带，左手持毛笔将蜡片带下端轻轻托起，右手用镊子夹起蜡带上端，正面向上放入展片仪水盒内，展片温度根据使用的石蜡熔点进行调整，一般水温为45℃左右，待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。对于展片困难的切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放人展片仪水盒内可使切片更易展平。在夏季切片时可用冰块冷却切片刀和组织块，减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。 3．捞起切片后，写上编号。捞片时注意切片的位置，一般切片的中心位于载物片右侧1/3与2/3交界处为佳，并注意整齐美观。 4．烤箱60℃左右烘烤切片30min，对血凝块和皮肤组织应及时烤片，烤片温度应稍低；脑组织切片捞出后直立晾干，再烤片，否则产生气泡。

9 方案二 石蜡切片的制作 1—6微米。制作大批的或是连续的切片。长期保存。 一、切片前的准备： 1、恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。
方案二 石蜡切片的制作 1—6微米。制作大批的或是连续的切片。长期保存。 一、切片前的准备： 1、恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。 2、蜡块整修，暴露组织并修平，减少刀的磨。 3．载玻片应事先洗涤干净，无油腻和不透明现象。涂粘片剂。 4、将锋利的刀片，调整角度和位置，以20°-30°为佳。 5、备用小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。

10 方案二 石蜡切片的制作 二、切片的步骤： 1、将蜡块固定于切片机头上的夹座内， 2、调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架 3、根据需要调整切片厚度。 4、修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再行切制。 5、切下的切片带，用毛笔从刀口向上挑起，拉下切片带

11 方案二 石蜡切片的制作 三、切片的注意事项 1、切片质量的好坏，与技术熟练程度和切片机、切片刀的好坏有关外。 2、切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。 3、在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则造成切片厚薄不均。或空洞现象。 4、在夏秋季节进行切片时，应使用冰块加强冷却，可保持石蜡的硬度，减少切片的褶皱。

12 方案二 石蜡切片的制作 四、贴片： 1、将单张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中（光亮的一面朝下）立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。 2、待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中轻靠切片，随即将玻片直立提起，拨正切片位置。 3、用铅笔在玻片的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。 4、贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。

13 实验1 石蜡切片的制做技术 试剂与器材：甲醛，酒精，二甲苯，苏木精，伊红，中性树胶，双面刀片，蜡板，镊子，滤纸，200ml容量瓶（广口）、玻璃标本缸，载玻片，盖玻片，染色缸，毛笔，新鲜鸡蛋，甘油 空闲时间：参观冰冻切片的制做 石蜡切片的制做程序（详细过程请查看讲义） 组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林2小时。 组织流水冲洗1－2小时。

14 实验1 石蜡切片的制做技术 70％酒精2－4小时。 85％酒精2－4小时。 95％酒精（Ⅰ）2－3小时。 95％酒精（Ⅱ）1－2小时。 100％酒精（Ⅰ）1－2小时。 100％酒精（Ⅱ）0.5－1小时。 100％酒精：二甲苯（1：1）0.5－1小时。 二甲苯（Ⅰ）20—30分钟。 二甲苯（Ⅱ）10—20分钟。 浸蜡（Ⅰ）40分钟。 浸蜡（Ⅱ）40分钟。 组织包埋。 蜡块整修。切片。贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时。

15 实验2 HE染色技术 二甲苯Ⅰ脱蜡 10分钟。 二甲苯Ⅱ脱蜡 10分钟。 100％酒精Ⅰ2－5分钟。 100％酒精Ⅱ2－5分钟。 95％酒精1－2分钟。 90％酒精1－2分钟。 85％酒精1－2分钟。 自来水洗      片刻 蒸馏水        片刻 苏木素  10—15分钟 自来水洗     1—2分钟 1%盐酸酒精分化 0.5—1分钟 流水冲洗 蓝化10分钟—至数小时

16 实验2 HE染色技术 蒸馏水冲洗    1－2分钟。 70％酒精1－2分钟。 85％酒精1－2分钟。 90％酒精1－2分钟。 伊红（醇溶）5-20秒 95％酒精（Ⅰ）1秒 95％酒精（Ⅱ）1秒 100％酒精（Ⅱ）1－2分钟。 100％酒精（Ⅱ）3－5分钟。 二甲苯（Ⅰ）5-10分钟。 二甲苯（Ⅱ）5-10分钟。 中性树胶封片。