埃博拉病毒实验室检测与诊断 李建东.

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1 埃博拉病毒实验室检测与诊断 李建东

2 埃博拉出血热临床表现与检测指标 抗原 IgM 抗体 IgG 抗体 5 10 20 15 25 30 35 发病后天数 3 16 6 7 2
25 30 35 发病后天数 抗原 3 16 6 7 IgM 抗体 2 9 29 168 IgG 抗体 18 19 749 死亡病例：出血征象，无尿，休克， 呼吸急促，迟钝，意思障碍 11 幸存者：肌痛，关节痛，乏力，肝炎，听力下降，眼部疾病，精神疾病 ? 早期症状：发热，寒战，头痛，肌痛，关节痛，乏力，腹痛，腹泻，咽痛，咳嗽，咽/结膜注射，皮疹

3 埃博拉出血热诊断 （一）诊断依据。 1、流行病学史：来自于疫区，或3周内有疫区旅行史，或有与患者、感染动 物接触。
2、临床表现：起病急、发热、极度乏力、牙龈出血、鼻出血、粘膜充血、瘀 点和紫斑、血便及其他出现症状；头疼、呕吐、恶心、腹泻、全身肌肉或 关节疼痛等。 3、实验室检查：（1）病毒抗原阳性；（2）血清特异性IgM抗体阳性。（3） 恢复期血清特异性 IgG抗体滴度比急性期有4倍以上升高；（4）从患者标本中检出埃博拉病毒 RNA;（5）从患者标本中 分离到埃博拉病毒。 （二）诊断。 本病的诊断依据流行病学史、临床表现和实验室检查。 1、疑似病例：具有以上流行病学史和临床诊断。 2、确诊病例：疑似病例基础上具备诊断依据中实验室检查任一项检测阳性者。

4 检测内容 （一）实验室检测: 主要包括埃博拉病毒核酸检测和IgM、IgG抗体检测。 （二）复核检测
1．具有开展埃博拉病毒检测资质的机构应将所有检测阳性和部分阴性的血清标本1 mL送中国疾病预防控制中心病毒病所进行复核检测。 2. 对检测阳性的标本进行病毒基因组序列分析。 3. 实验室检测阴性的疑似病例，应连续采集系列血标本进行病毒核酸、IgM、IgG抗体检测。

5 实验室检测方法 （一）病原学检测。 1．核酸检测：为目前早期诊断、早期发现埃博拉出血热病例的主要检测方法：采用荧光定量 PCR 进行病毒核酸检测，患者标本中扩增到特异性核酸，可确诊埃博拉病毒感染 。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。 2. 病毒抗原检测：用酶联免疫法检测埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原检测阳性可确诊。 （二）血清学检测。 1. 血清特异性IgM抗体：采用捕获法ELISA方法检测。疑似病例具有疫区旅行史或患者接触史，IgM抗体阳性，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。 2.血清特异性IgG抗体：目前主要采用间接法ELISA或免疫荧光方法检测IgG抗体。单份血清埃博拉病毒IgG抗体阳性为曾感染埃博拉病毒，双份血清埃博拉病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍或者以上增高者，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。

6 个人防护 个人衣、物要去除，换上实验室专用工作服（手术服）；
可遮盖全身的合适的防护服、乳胶手套、口罩、帽子、防渗漏 防护服、乳胶手套、高筒鞋套、防护面罩（正压头盔）等； 注：手套、防护服大小要合适，检查有无破漏；手套的量要充足，满足随时更换。 所有涉及感染性材料的操作均应在BSL-3实验室二级生物安全柜 内进行； 方便取用的消毒剂（0.5%次氯酸钠溶液、75%酒精等），空间喷 雾消毒设备（使用过氧乙酸，过氧化氢等）。

7 检测对象 （一）疑似患者。 （二）密切接触者。 （三）当临床救治需要时或出院前的患者。
用无菌真空干燥管，采集患者、疑似患者以及 密切接触者非抗凝血，每份5mL（根据采血管大小确定，每 管采血量要少于常规采血量）。标记清楚后4℃保存，填写 基本信息。

8 包装、运输 A类包装，符合UN2814要求，按照三重包装系统包装： 第一层包装（可密封样本袋、50mL离心管）；第二层安 全壳容器（防水、防漏）；外层运输包装组成。样本袋 放入防水防漏的第二层安全壳容器中，为降低破碎或泄 漏的风险，用吸水纸等填充物固定标本袋。安全壳容器 和外包装放冰袋。 全血采用冷藏运输，血清可采用冷冻运输，在第二层、 外层容器之间放置冰袋。 不要打开采集管或分装样本。

9 标本容器 第一层 2mL,可离心有垫圈 第二层 15mL,封口膜封口 易标记
There are exceptions to this rule, as some samples, such as eggs, soil, hepa filters, or Biskit sponges and bottle ports, WILL NOT fit into a microcentrifuge tube. In these cases, a 50ml Falcon tube,an appropriately sized evidence bag or other container may be used as the primary container and must therefore be overpacked in something which is suitable.

10

11 第二层也可用50mL离心管 自封袋

12 标本的接收和处理 单位内指定部门接收样本，按既定程序转运至检测实验室。
观察外包装，如无破损，可填写交接双联登记表，运至BSL-3实验室传递窗处打开外包装，将包装容器内的第二层包装取出，放在传递窗内，外包装留在传递窗外。进入进生物安全三级实验室的缓冲间后，将第二层包装从传递窗取出，带入生物安全三级实验室核心区。在生物安全柜中，打开第二层包装，观察内层包装，核对标本单中患者的姓名、标本名称、标本编号、采样时间，并做好记录，并详细记录标本的数量和体积。第二层包装盒喷洒消毒剂后置于医用垃圾袋内进行高压灭菌消毒处理。 如外包装破损严重，则应喷洒0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠消毒剂并在外包装增加一层塑料袋，转至BSL-3实验室30 min打开包装，查看第二层包装。第二层包装或内包装破碎时应按照《感染性样品实验活动应急预案》处理，喷洒0.5%有效氯的次氯酸钠消毒剂消毒，并采取空间消毒，及时上报。

13 标本的分装 在生物安全柜中用止血钳缓慢打开送来的标本内包装，全血标本需进行血清分离然后进行分装，血清标本可直接进行分装。每份不多于1 mL分装入带螺旋密封的2.0ml冻存管内，盖紧盖，管上表明编号、标本量，放入标本盒中。做好记录（记录纸、笔、冻存盒不得进入生物安全柜中）。 感染性标本要与灭活标本分开保存，易于识别。 分装标本所用的移液吸头及标本空管应立即弃入含0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠消毒液的防破碎的容器中，再放入垃圾桶内高压消毒处理。

14 标本的灭活 用于实验室检测所需要的标本管，螺丝口盖盖好后，外表面用 含0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠溶液消毒，短暂离心后，将标本管插入泡沫浮漂内，确保冻存管稳固插好，用托盘将安装好的标本管移到水浴箱处，观察水浴箱水温是否达到60℃，将标本管放入水浴箱后，盖好水浴箱盖，水浴60℃ 60分钟进行灭活。 对灭活的整个过程做好记录，包括：灭活标本的数量和体积、水浴箱的运行状态（尤其温度等参数）、放入标本管的时间、取出标本管的时间、操作人及审核人等。 标本灭活后，将标本管从水浴箱取出，擦拭表面后，送入生物安全柜中，进行后期工作。 剩余标本可弃入废弃物袋内，高压灭活。如需放入冰箱内保存，应标记清楚与未灭活的感染性物质保存于不同冰箱或抽屉，易于区别。

15 标本处理过程中可能存在的意外 处理疑似患者血标本时，如非抗凝血血清分离、血清分装、灭活等过程中振荡混匀及离心过程中可能有气溶胶的产生、液体的溅出或滴洒等危害。应事先在台面上铺防水纸垫，喷洒新鲜配制的含有0.5%有效氯的次氯酸钠溶液，移液时使用有滤芯的滴头，不能使用负压吸引器。移液过程中，如果血标本滴落在管壁和管口上或生物安全柜的台面，手接触感染材料，应及时消毒处理，喷洒含有0.5%有效氯的次氯酸钠溶液，再用75%酒精棉球进行擦拭。若手接触感染材料，用75%的酒精消毒后脱去最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦试管壁，将污染的纱布放在医用垃圾袋内，进行高压处理。

16 生物安全要求 1．凡涉及埃博拉病毒的未经培养的感染材料需在生物安全3级（BSL-3）实验室内进行分装、灭活等实验活动。核酸提取时，加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2及以上实验室进行。血清学检测时，应先60℃1小时灭活，灭活材料免疫学检测应在生物安全3级（BSL-3）实验室内进行。 2．在进行感染性材料操作时，如样本量≤1mL/份，每次操作标本不应超过12份；如果1mL/份<样本量≤5mL/份，每次操作标本不应超过6份；如果样本量＞5mL/份，每次标本操作不应超过3份。

17 核酸检测流程图 反应体系混合物 正、反向引物混合物 20 µl 5 µl 反应条件取决于病原体特异性 1) 核酸分离，BSL-3
特异性荧光探针 20 µl 合适的PCR管 PCR仪 5 µl 反应条件取决于病原体特异性 1) 核酸分离，BSL-3 2) Real-time PCR 检测 17

18 实时定量RT-PCR方法 引物/探针 序列 引物探针1 ZEBOV-F CGCCGAGTCTCACTGAATCTG ZEBOV-R AGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGT ZEBOV-P FAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1 引物探针2 EBOGP1D-fwd TGGGCTGAAAAYTGCTACAATC EBOGP1D-rev CTTTGTGMACATASCGGCAC EBOGP1DZ-Prb FAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1 RNA模板5µl，酶（25x）1µl，缓冲液12.5µl，引物（10uM）各1µl，探针（10uM）0.5µl，加水至总体积25µl。 推荐反应条件为50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反应40个循环 。 结果判断：以定量荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检测阳性。

19 2套实时定量PCR检测方法检出限50～100拷贝 1套引物探针序列与目前西非流行株一致；
SEBOV y=-3.533x+38.41 R2=1.000 CEBOV y=-3.478x+38.87 R2=0.999 ZEBOV y=-3.469x+39.75 R2=0.999 BEBOV y =-3.470x+38.75 R2=1.000 REBOV y= x+38.54 R2=0.999 ZEBOV y=-3.540x+39.69 R2=1.000 体外转录RNA参考品 1套引物探针序列与目前西非流行株一致； 1套采用兼并引物，与目前西非流行株差别2个碱基，但理论上不影响检测。

20 常规RT-PCR方法 结果判断：阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染，但一般情况下需经序列分析确诊。 引物 序列 大小 方法1
EBVGP F 5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’ EBVGP R 5’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’ 570bp 方法2 Filo-A1 ATCGGAATTTTTCTTTCTCATT Filo-B1 ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG 414bp Filo-A2 GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGG Filo-B2 ATAATAATCACTCACATGCATATAACA 282bp 结果判断：阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染，但一般情况下需经序列分析确诊。

21 酶联免疫法检测埃博拉病毒核蛋白抗原、抗体
BSL-3实验室60℃1小时灭活，样本量不超过0.5mL； 可能存在灭活不彻底，出现残存的感染性材料的滴洒或溅出，或在洗板过程中形成气溶胶感染实验者。应禁止采用喷壶手洗的方式洗板，而应采用密闭的洗板机进行洗板。ELISA板洗涤过程中，需用密闭戴盖容器盛装废液，容器内实验前添加含10%有效氯的消毒剂，添加量要使废液瓶充满时有效氯浓度不低于0.5%。洗板量较大时，应使废液瓶有足够空间收集冲洗和消毒洗板机的废液，废液瓶满时，应停止洗板，作用30分钟，将废液瓶移至生物安全柜，倒入适合高压的废液瓶中，以便进行高压处理。 检测试剂尚未经实际临床标本评价，应结合流行病学资料，临床表现综合判断，阳性结果提示患者埃博拉病毒感染，用于埃博拉出血热早期诊断，阴性结果并不排除埃博拉病毒感染的可能。

22 基于病毒核蛋白抗原的免疫学检测方法 双抗体夹心ELSIA检测抗原方法，检测限约低于10ng；
ZEBOV-NP SEBOV-NP CEBOV-NP REBOV-NP BEBOV-NP 双抗体夹心ELSIA检测抗原方法，检测限约低于10ng； 基于核蛋白的IgM检测方法（MacELISA）； IgG抗体间接法ELISA检测方法。

23 感染性血清标本的保存和销毁 待检血清，60℃ 1小时水浴箱内灭活后，暂时保存于4℃冰箱；其他所有血清样本，在获得实验室检测结果之前，暂时保存BSL-3实验室内双人双锁的-70℃以下冰箱。 实验室检测埃博拉病毒阳性血清，在实验室主任的批准后，转入所高致病性微生物毒种库内保存，转运时需告知所生物安全委员会主任。转运过程中，需实验室管理处和保卫处人员在场。标本出BSL-3实验室时，必须使用含0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠的消毒剂擦拭冻存盒的外层，擦拭后应确保标记清楚，在传递窗中放入运输箱内，箱内铺垫有含5000mg/L有效氯的次氯酸钠的消毒剂的吸水物质，传出生物安全三级实验室工作区，再转入所高危病毒毒种库内保存。

24 感染性血清标本的保存和销毁 感染性样品的保存实行“双人双锁”管理和取样“审批”制度。储存样品的冰箱为“双人双锁”，钥匙分别由两人保存，只有实验室负责人和所生物安全委员会主任双审批同意后，在所保卫处人员在场的情况下，由两人打开冰箱取样。任何人不能单独取走样品。实验室样品保管员负责对样品的状况、数量进行记录，负责定期检查样品保存状况。 涉及埃博拉病毒感染性样品的实验活动，实行“审批”制度，使用埃博拉病毒感染性样品时，须填写书面申请，经实验室主任批准，报所生物安全委员会同意批准后方可使用，并进行详细记录。任何人未经实验室主任和所生物安全委员会批准，不得私自开展相关实验活动。

25 感染性血清标本的保存和销毁 实验室检测埃博拉病毒阴性血清，应在2个月后，所采集血清的疑似患者或密切接触者完全排除埃博拉病毒感染后，实验室主任可决定该血清样本转入其他血清库保存冰箱或销毁。 所有血清销毁时，均应在冰箱内取出后，至于BSL-3实验室生物安全柜内，待其自然融化后，直接在60℃ 1小时水浴箱内灭活，然后置于含有0.5%有效氯消毒剂的塑料袋或桶内高压灭活。 所有销毁血清均应在相应数据库清单内标明，血清销毁的时间和操作人，阴性血清销毁记录保存1年以后可以清除，阳性血清的销毁记录应保存5年以上。

26 基于埃博拉病毒假病毒颗粒的中和抗体检测方法
(由于涉及细胞培养暂不能用于检测） 建立埃博拉病毒膜蛋白包装制备的假病毒颗粒，可用于具有高度特异性的中和抗体检测。 初步优化了基于假病毒颗粒的中和性抗体的检测方法，并储备了假病毒颗粒型试剂。

27 谢 谢！