第十六章 细胞因子与细胞粘附因子的测定.

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1 第十六章 细胞因子与细胞粘附因子的测定

2 第一节　生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价 第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价

3 第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用
一、临床应用原则 二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后 思考题 小结

4 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。
细胞因子 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 细胞粘附因子 是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。

5 第一节 生物学测定方法

6 生物学测定法分类 1.基于DNA检测的分子生物学测定法： DNA扩增法 RNA印迹法 原位杂交法 核酸酶保护分析 2.生物活性测定法

7 生物活性测定法原理 有 助 于 细 胞 因 子 检 测 的 活 性 作 用 包 括
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示 刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用 有 助 于 细 胞 因 子 检 测 的 活 性 作 用 包 括 有助于细胞因子检测的活性作用

8 一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法 以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。

9 细胞增殖检测方法分类 直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法
3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法

10 (1) 放射性核素掺入法 优点 缺点 结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I ），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。 优点 缺点 结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染

11 常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件
细 胞 株 所需浓度（细胞数/ml） 3H-TdR前培养时间 3H-TdR后培养时间 检测细胞因子 D10G4.1 2×105 48 18-20 IL-1 L929 56 16 CTLL-2 105 24 4-6 IL-2 FDC-P1,32DCL-27 5×104 4-8 IL-3 CT.4S IL-4 CH12 5×103 6 IL-5 B13 36 12 T88-M 1×105 BCL1 72 Clone-K,I×N/2bx IL-7 TS1 3×104 66 IL-9 T10 IL-11 UT-7 1.5×105 SCF （干细胞因子） CCL-64* 5×108 8 TGF-β DA3.15, IF GM-CSF M14/NES60.4 M-CSF/G-CSF

12 (2) MTT 比色法 不同点 相同点 与同位素掺入法相比 掺入物：MTT而非3H-TdR； 测定步骤类似
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 与同位素掺入法相比 不同点 相同点 掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同 测定步骤类似

13 细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞
细胞株/原代细胞 细胞终浓度（细胞数/ml） 加入MTT前温育时间（h） 检测细胞因子 B9，MH60,BSF2,TTD1 5×104/2×105 96/48 IL-6 B9-11 5×104 96 IL-11 B9-1-3 IL-13 KYM-1D4 2×103 72 MV-3D9 5×103 120 TGF-β WEHI-164/clone13 TNF 32D/Mp110S 1×103 44 L929 2×105 56 CTLL-2 105 22-24 IL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-27 1.5×105 IL-3

14 二、细胞毒活性测定法 基本原理 本法常用于TNF等的测定
对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。 基本原理 本法常用于TNF等的测定

15 三、抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株 常用于攻击细胞的病毒 检测抗病毒活性的方法 Wish、Hep2/c 人干扰素
L 小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ 常用于攻击细胞的病毒 VSV、EMCV及Sindbis virus等 检测抗病毒活性的方法 细胞病变效应(CPE)、 抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量 本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（CPE）。

16 细胞毒活性测定法常用于TNF等的测定 TNF-α和TNF-β与同一受体结合，故两者生物学活性相似
TNF活性测定靶细胞：小鼠成纤维细胞株L929、L-M、WEHI164.13 注意： 若选用L929细胞，其不宜生长过密。 细胞被某种因素激活后，代谢增强，线粒体脱氢酶活性也增强， 着色也会加深。 MTT染色时，必须考虑待检样品中有无激活靶细胞的因素。

17 细胞病变抑制法结果判断举例* 细胞病变程度分为5个等级，即：
“0”，表示无明显CPE； “1+”，CPE≤25％； “2+”，CPE为25～50％； “3+”，CPE为50～75％； “4+”，CPE为75～100％。根据病变程度找出CPEI50的标本稀释范围，并以此计算出距离比例和确定IFN效价。 该法操作复杂、影响因素较多，在试验前应对所用的病毒进行滴定。 标本稀释度log4 两孔平均CPE 细胞病变 抑制程度 抑制积累 积累 抑制率 3 4 16 16/16 (100%) 12 12/12 5 8 8/8 6 1.5 2.5 4/5.5 (73%) 7 1.5/5.5 (27%) 0/8(0%) *结果：CPEI50稀释度介于 之间，距离比例为(73-50)/(73-27) =0.50，效价为46.5；同法计算IFN标准品的CPEI50稀释度，将IFN效价换算成国际单位，IFN国际单位=样品CPEL50的稀释度/标准品CPEI50稀释度×标准品的单位。

18 四、趋化活性测定法 趋化因子诱导细胞移动的方式 趋化性(chemotaxis)：
诱导细胞向由趋化因子低浓度出向趋化因子高浓度处作定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。 化学增活性(chemokinesis)： 细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。

19 五、生物学活性测定方法学评价 敏感性较高 特异性不高 操作繁琐 易受干扰

20 第二节 免疫学测定法 细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体( 单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示， 从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。

21 一、ELISA方法 根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISA可分为： 1. PcAb与McAb夹心法 2. McAb与PcAb夹心法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定 根据抗体性质和特异性不同，夹心法ELISA可分为： 1. PcAb与McAb夹心法 2. McAb与PcAb夹心法 3. 双McAb夹心法 4. 细胞、McAb夹心法

22 ELISA 优点 缺点 特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理 细胞因子测定的首选方法 敏感性偏低
不能判断细胞因子的生物学活性。

23 二、流式细胞分析法 基本步骤 1．分离和培养待检细胞 2．细胞固定 3．封闭非特异性结合位点 4．染色与分析
流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。 1．分离和培养待检细胞 2．细胞固定 3．封闭非特异性结合位点 4．染色与分析 基本步骤

24 使用流式细胞分析法，可以： 区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN-γ Th2细胞 IL-4 细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：
单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态

25 三、酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)
基 本 原 理 一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关

26 四、免疫学测定方法学评价 优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。 缺点：
所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合

27 第三节 细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用
细胞因子的测定主要应用于： 特定疾病的辅助诊断 机体免疫状态的评估 临床疾病治疗效果的监测和指导用药 疾病预防

28 一、临床应用原则 细胞因子和粘附分子的异质性、功能交叉性和多样性、来源的复杂性和组织细胞的非特异性，决定了在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断作出综合考虑。

29 （一）方法的联合应用 细胞因子的检测方法多种多样，各有利弊。 高敏感性方法：特异性的降低、废弃物难处理 活性测定方法：定性试验
基因分析法：利于细胞内定位分析、操作烦琐

30 （二）标本的适当选取 常用临床标本：抗凝全血，并分离获得单个核细胞 炎症局部细胞因子的水平：局部分泌液
细胞因子或粘附分子的细胞内定位检测：相应细胞 相应细胞因子的基因和mRNA表达：相应细胞 疗效观察和预后判断：疾病急性期和恢复期双份标本进行动态观测 免疫荧光染色和流式细胞分析：注意待检细胞的活性和状态，以保 证结果的特异性

31 （三）细胞因子的联合检测 意义： 细胞因子具有网络调节的状调节的特点 级联效应或相互抑制作用的网络系统。
有助于提供有效的疾病诊断和机体免 疫状态信息 举例： T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的 功能：IL-1、 IL-2、IFN-γ和GM-CSF Th1/Th2细胞平衡状态：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ

32 （一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义
二、特定疾病诊断的辅助指标 （一）细胞因子检测在特定疾病诊断中的意义 许多疾病过程均可出现粘附分子和细胞因子表达的异常改变，高表达、低表达或是缺陷均可与某些特定疾病密切关联，同时还可反映疾病的进程

33 （二）粘附分子检测在特定疾病诊断中的意义
粘附分子有可溶性和膜结合性两种形式，均与机体的免疫状态和疾病的发生有关，在炎症、肿瘤转移和器官移植排斥反应中发挥着重要的作用。相关粘附分子的检测有助于此类疾病的诊断。

34 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
机体免疫应答的强弱可通过细胞因子或粘附分子的表达水平来反映，其过高或过低表达均系免疫调节异常的结果 细胞因子和粘附分子的水平，作为观察治疗效果和判断预后的重要指标 接受治疗的患者进行细胞因子水平的监测，对保证治疗效果具有指导意义 。

35 思考题 1．细胞因子和细胞粘附分子的特性是什么？可分为几类？
2．基于促进细胞增殖生物学活性，检测IL-1、IL-2、IL-3、TNF等方法所使用的细胞依赖株与检测原则是什么？ 3．细胞因子生物活性测定法的种类，各用于哪些细胞因子的检测，主要优缺点？ 4．ELISA法在细胞因子和粘附分子检测可应用于哪些方面？ 5．ELISPOT的原理、用途、与ELISA的异同是什么？

36 6．在应用流式细胞术分析细胞因子时，需要哪些靶细胞活化剂？各自的作用是什么？
7．与细胞因子的生物活性测定法相比，免疫测定法的优势是什么？如何看待其现有的劣势？试推测解决现存的不足和改进方法的可能途径。 8．在临床疾病诊断中，检测细胞因子和粘附分子的意义是什么？应用细胞因子检测方法的原则有哪些？ 9．如何利用细胞因子检测来判断Th1/Th2细胞平衡？ 10．如何从细胞因子检测的角度，了解机体T细胞、巨噬细胞等细胞的功能？

37 小 结 细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。
小 结 细胞因子和粘附分子是构成免疫应答的重要物质基础，检测这些分子可反映机体的免疫状态。 细胞因子或粘附分子的检测方法包括生物学测定法和免疫测定法两大类。 细胞因子和粘附分子检测的临床意义。对某些特定疾病具有诊断价值；对细胞因子治疗具有监测和指导用药的意义；对机体的免疫状态具有评价作用。