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第十三章 基因治疗的原理 与研究进展 Chapter 13 The Advance and Principle
第十三章 基因治疗的原理 与研究进展 Chapter 13 The Advance and Principle of Gene Therapy
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基因治疗分类 体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变
只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代
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内容提要 一、基因治疗的策略 二、基因转移技术 三、基因干预 四、治疗基因的受控表达 五、基因治疗的应用研究
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一、基因治疗的策略 The Strategy of Gene Therapy
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（一）基因置换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。
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基因同源重组技术 又称为基因打靶(gene targeting）
定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。
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要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。
定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。
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（二） 基因添加 基因添加或称基因增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。 类型:
在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
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（三）基因干预 基因干预（gene interference）:
采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
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（四）自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。
原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。
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自杀基因的作用机制
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1.自杀基因系统 ☻TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 ☻CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。
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2. 旁观者效应 旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
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（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
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二、基因转移技术 The Technique of Gene Transfer
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基因治疗的两种途径 ex vivo 靶细胞 载体 目的基因 in vivo
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基因转移(gene transfer)技术：
1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。
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1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。
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（1）逆转录病毒 Retrovirus
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逆转录病毒前病毒的结构特点 （1）两端各有一长末端重复序列LTR。 （2）LTR由U3、R和U5三部分组成。
(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。 （3）病毒有三个结构基因 (1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； (2)pol基因，编码逆转录酶； (3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 （4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。 （5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。
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逆转录病毒介导的基因转移系统 ——由两部分组成：
(1) 逆转录病毒载体 (2) 辅助细胞株(如PA317)
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Retroviral packaging system
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逆转录病毒载体的特点 ①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。 ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。
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逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。
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（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。
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腺病毒的优点 1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关；
4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；
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1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。
腺病毒载体缺点 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。 4.靶向性差。
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（3）腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 AAV Virus Particles
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Structure of AAV Virus Genomic DNA
REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因
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AAV的特点 ● 以潜伏感染为主； ● 病毒基因组与细胞共存； ● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；
● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。
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AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13
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AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%-80%的成人中存在过感染，
可能会引起免疫排斥。
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2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。
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脂质体介导的基因转移示意图
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（2）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。
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受体介导转移技术示意图
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（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。
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1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；
基因直接注射法的优点 1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。
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三、基因干预 Gene Interference
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基因干预的种类： 1.反义RNA (antisense RNA) 3.核酶 (ribozyme)
2.干扰RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme)
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（一）反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。
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反义RNA的关键技术问题： ☻专一性转移问题： ☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题
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2.受体介导反义RNA技转移术 借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。
将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。 ①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高； ②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。
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受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在 一定程度上补充了转基因治疗的不足。
（l）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒 在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。
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（二）干扰RNA 1.RNA干扰现象 RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。 对RNA干扰的认识来源于用线虫（C. elegans）和果蝇所进行的实验。 实验结果显示，有义链RNA（sense RNA）或反义链RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。将特异的双链RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNA和反义链RNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。
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2.RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA）
长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）。 （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。 该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。
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A. 贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构； RNA干扰机制示意图
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siRNA的产生 1. 体外化学合成; 2. 用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。
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3.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。
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（1） 研究基因功能的新工具 由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。
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（2） 肿瘤的基因治疗 传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。 K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关，用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。 通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。 应用RNA干扰技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。
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（3） 病毒性疾病的基因治疗 RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻碍HIV在细胞内复制。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。
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siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，RNA干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。
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（三）核酶(ribozyme) 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。
在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。
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1. 核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。 在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。
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核酶的作用机制
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2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。
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四、治疗基因的受控表达 Regulated Expression of Therapeutic Gene
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治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的时间、空间和水平三个方面。
时间: 1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态； 2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。 空间: 表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。 是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产生毒副作用。 要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。
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（一）基因内部的调节机制 ☻使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 ☻使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件
（一）基因内部的调节机制 ☻使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 ☻使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件
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1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件
不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。 例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。 前列腺特异性抗原(PSA)是参与精液凝块中蛋白质降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，可以利用PSA基因调控元件驱动治疗基因在PSA阳性的前列腺癌细胞中表达而发挥作用，而其在PSA阴性细胞和非前列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。
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2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件
某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。 甲胎蛋白(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。 癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中表达很高，采用其启动子可以使治疗基因只在CEA阳性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。
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（二）基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。
Egr-1基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因)导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，杀死肿瘤细胞。 采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。 组织纤溶酶原激活物(t-PA)作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。t-PA的活性在辐射后增加50倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。
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（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达
病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。 肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)和缺氧响应元件(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。 例如，在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。 机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。
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（四）治疗基因的诱导表达 采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱导性基因表达系统。 这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与DNA结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。
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四环素抗性操纵子系统原理 四环素抗性基因的转录受Tet阻遏蛋白的负调控。
无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达； 四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。
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五、基因治疗的应用研究 The Application of Gene Therapy
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世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。1990年9月美国Blaese博士成功地将正常的人的ADA基因植入ADA缺乏症病人的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。
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（一）遗传病的基因治疗研究 已知人类有4000多种遗传病，在人群中的发病率约为40％～50％。但真正了解病因，能进行产前诊断的仅限于那些为数不多的常见遗传病。 遗传病基因治疗必须符合以下要求： 1.在DNA水平明确其发病原因及机制； 2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传； 3.该基因的表达不需要精确调控； 4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞(如皮肤细胞，骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用； 5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过只有30余种遗传病。
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1．腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症 2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5．莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征 6．家族性高胆固醇血症 7．囊性纤维化病
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（二）恶性肿瘤基因治疗研究 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。
（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移； （2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用； （3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应； （4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。
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1.肿瘤基因治疗的基本策略 (1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。 (2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。
从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基因治疗的策略包括： (1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。 (2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。 (3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。
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☻肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。
2.肿瘤基因治疗的常用方法 ☻基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。 ☻自杀基因治疗—分子化疗：直接杀死肿瘤细胞。 ☻肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。 ☻提高化疗效果的辅助基因治疗： 药物增敏基因治疗； 耐药基因治疗。
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3.自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。
基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞“自杀”。这些基因也相应地被称为“自杀基因”。
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自杀基因治疗的前提条件是“自杀基因”的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。
自杀基因转移常用方法 ①利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。 ②利用病毒载体进行基因转移。 ③肿瘤特异性基因转录。 ④肿瘤内直接注射。
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4.肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法。主要包括细胞因子（或受体）基因治疗和抗原抗体基因治疗两大类。
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5.提高化疗效果的辅助基因治疗： 临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：
（1）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。 （2）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。
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(1)药物增敏基因治疗： 为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。 将鸡钙调素（calmodulin, CaM）基因导入小鼠乳腺癌细胞株C127，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，CaM基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，明显增加了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。
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(2)耐药基因治疗： 肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白或酶有关，包括多药耐药（mdr-1）基因编码的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白（MRP）以及近年来发现的肺耐药相关蛋白等；还有细胞内氧化和解毒作用的酶系统，包括细胞色素P-450（cytochrome P-450）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等等。 目前除了开发针对肿瘤细胞耐药性产生机制的拮抗剂，如用于阻断P-糖蛋白所引发多药耐药的戊脉安（verapamil）和用于阻断GSH合成的丁硫氨酸亚砜胺（BSO）等。还采用基因干扰技术，在基因水平阻断耐药基因的表达，使肿瘤细胞丧失多药耐药性，从而易于被化疗药物杀死。 在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，如mdr-1基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。
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（三）病毒性疾病的基因治疗研究 据统计，75%的人类传染病是由病毒引起的。病毒感染人体后不仅可能急性发病，还可以在人体内长期潜伏，造成终身伤害。病毒还是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它与某些癌症、自身免疫性疾病和内分泌疾病也存在一定的联系。迄今为止，临床上对绝大多数病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治疗手段，而在众多开展的抗病毒治疗方案中，抗病毒基因治疗十分引人注目。
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1．调节机体免疫应答： （1）将细胞因子(如干扰素、白细胞介素等)的基因，导入机体免疫细胞，激活免疫细胞并促进其增殖分化，增强机体的细胞和体液免疫应答，促进机体清除病毒感染细胞和游离病毒。 （2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防御作用。
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2．抗病毒复制：根据病毒在机体细胞中复制周期的各个环节来设计的，主要包括：
（1）抑制病毒与宿主细胞结合：即阻断病毒表面抗原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。 （2）干扰病毒基因组的转录起始和调控。 （3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成。 （4）RNA干扰技术。 （5）将抗病毒蛋白质基因，如2ˊ→5ˊ腺苷酸合成酶等基 因，导入机体细胞并持续表达，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA，对RNA病毒的感染产生明显的抵抗作用。
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（四）其他疾病的基因治疗研究 神经退化性疾病（如帕金森氏病）:由于腺病毒可以感染有丝分裂后的细胞，同时具有潜在的高转导效率和在中枢神经系统免疫特惠区（immunologically privileged site）中的低病原性，因此是进行神经系统疾病基因治疗的有效载体。 两种传递治疗基因的主要策略： （1)重组载体的脑内直接注射； (2）采用取出体内细胞在体外经由载体转染修饰后回输脑内相关区域。 神经母细胞（neuroprogenitor）和人星型胶质细胞可以作为自体同源细胞用于ex vivo修饰。使用四环素调节的腺病毒载体来表达酪氨酸羟化酶在动物模型中用ex vivo技术表现出了可观的前景。在用脑衍生神经营养因子（BDNF）腺病毒重组体缓解亨廷顿疾病的实验过程中，发现表达BDNF的大鼠取得了明显结果。
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基因治疗的问题与展望 治疗基因调控元件的选择； 安全高效载体的构建和转移技术的 选择； 靶细胞的选择。
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