实验室安全教育 新生培训 放射医学与防护学院 吴 艳 办公室：401#1124.

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1 实验室安全教育 新生培训 放射医学与防护学院 吴 艳 办公室：401#1124

2 安全培训的目标 学习怎样保护你自己的安全，以及实验室仪器等财产安全 尽量做到预防为主，将安全事故扼杀在摇篮里。
在这个可能存在危险的情况下，让大家更安全、更健康、工作更顺利、学习、生活得更加美好！

3 不安全的环境 实验室内各项硬件设备的陈设放置或维护不当而形成的不安全环境 气体钢瓶未固定妥当，易因地震或其他因素造成倾倒、滚动，引爆炸
电器电线老旧，易造成漏电 事件或因电线走火引发火灾。

4 不安全的行为 实验室中常见的不安全行为包含以下三项： 1.不适当的态度 2.缺乏知识或技能 3.不适当的机械或物质的操作行为

5 不安全的行为 不按照标准要求穿着工作服 用鼻子闻试剂 使用标签不明的试剂 称取腐蚀性药品不带防护用具

6 在实验室里必须有一个严谨的态度 培养好的实验习惯对科研工作有益！
1. 良好的卫生整理习惯： 要勤打扫实验室卫生，做好实验器材的储存工作； 不能挡住紧急器材的通道。 2. 实验室不准吃东西、喝饮料、吸烟、或者化妆。 3. 实验时候要带手套，穿实验服，戴防护眼镜，穿不露脚趾的鞋子，实验完成后要洗手。 4. 不准将试剂带回家，不要直接去闻或者尝化学试剂，不要用嘴去吹移液管里边的液体。 5. 要分清工作区和生活区，污染区和洁净区。 培养好的实验习惯对科研工作有益！

7 实验室安全涉及面 水 电 气 火 试剂 放射性 病原微生物 仪器使用 废液处置

8 1. 实验室用水安全 水龙头或水管漏水时，应及时地修理 下水道排水不畅时，应及时地疏通。
冷却水：上水管与水龙头的连接处及上水管、下水管与仪器或冷凝管的连接处必须用管箍夹紧；下水管必须插入水池的下水管中。 人离开，水要关掉。

9 2. 实验室用电安全 电器、电线的老旧，易造成漏电事件或因电线走火引发火灾。
连线：仪器连线必须使用带有接地的三根线的护套线，不可使用普通的塑料绞线。严禁私拉乱扯。 接地：仪器应有良好的接地，提高仪器的稳定性及安全系数。 维修：维修仪器时必须切断电源，方可拆机修理。 人离开实验室，正在反应的搅拌器，应将搅拌速度调小（晚上用电器少，速度加快，易打破或打翻反应瓶，引发安全问题），其它电器，一律检查关闭。

10 3. 实验室气体安全 搬运：搬运或转动钢瓶时，要用推车，不得用手执着开关阀移动。
气瓶要远离热源；避免曝晒和强烈振动； 所有气瓶都必须有铁链等保护，避免气瓶翻到伤人。 气瓶内的气体不可用尽 惰性气体：应剩余0.05MPa以上压力的气体。 可燃气体：应剩余0.2Mpa以上压力的气体。 氢 气：应剩余2.0MPa以上压力的气体。

11 4. 实验室用火安全 禁止使用电炉、电热器等有明火的电器。 严禁在开口容器或密闭体系中用明火加热有机溶剂。
不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。 使用氧气钢瓶时，不得让氧气大量溢入室内。 禁止在实验室、学习室内吸烟或使用明火，禁止乱拉电线。 定期检查消防器材。未经许可，禁止擅自移动。

12 长头发的男、女同学要注意 -潜在的危险： -长头发的学生在使用酒精灯时， 头发没有束起因而有机会会着火。 -避免意外发生的方法：
-在实验室内同学要把长头发束好， 确保束发的绳子不会松开。

13 酒精溅在桌上并着火的对策： -用湿抹布盖灭 -利用沙桶把燃烧的液体用沙盖着。

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15 5.化学试剂的存放 实验室里尽量少堆放一些化学试剂。 不能将化学试剂随便放在地板上。
储存在架子上或者高点地方的化学试剂，必须是被挡住着的。液体化学品要放在最低层。 有些化学品要用两个容器盛放，以防止其中一个被打烂或者漏了。 一些不兼容，不能放子一起的化学试剂要分开存放。 实验室冰箱要详细标记里边所盛放的样品，用装化学品的冰箱绝对不可以放吃的东西。

16 为什么有一大阵酸味的？ -潜在的危险： -试剂瓶没有用盖子盖好，内里有毒的物质可能会外泄。 -避免意外发生的方法：
-使用试剂瓶后必须立即把瓶盖盖好。

17 6. 实验室病原微生物安全 确定相关病原微生物是否能在普通实验室操作，还是需要在更高级别的实验室进行。
传染性病原微生物必须在生物安全柜里进行。 含有微生物的试剂或者废液不可随意倾倒，必须高温高压灭菌。 使用过的试管和瓶子要用1%新洁尔灭浸泡过夜后再清洗。

18 7. 仪器使用安全 仪器使用者必须认真地阅读操作规程，经过培训方可上机操作 。 必须严格地按照“仪器操作规程”进行操作 。
遇到仪器发生故障，立即向管理人员报告，不得擅自处理。 发现安全隐患应立即报告，及时处理。 不得擅自挪用与公用仪器相关的辅助设备和零、配件，以及实验室内的一切公用设施。

19 高压灭菌器 特种设备：由取得特种设备资格证人员操作 确保水位在指定位置 升温升压时仔细观测仪器情况 使用时人不能离开

20 干燥箱 调整温度后待温度稳定方可离开 保证门关严实 东西不能放太多 塑料制品不要放在最下一层和不要贴近后壁

21 离心机 平衡 水渍擦干净 选择合适的离心管 使用时人不能离开

22 生物安全柜和超净工作台 生物安全柜内部能点酒精灯 超净工作台先开风机后点酒精灯

23 8. 废物处理 1. 严禁将有毒、有害、强腐蚀性试剂及液体倒入水池中。将装有废液的容器放在指定地点，统一处理。
2. 微生物废弃物要经过高温高压灭菌后方可丢弃。 3. 动物尸体放到指定位置。

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28 荧光显微镜 扫描型激光共聚焦显微镜 上转换激光共聚焦显微镜
荧光显微镜 扫描型激光共聚焦显微镜 上转换激光共聚焦显微镜

29 Fluorescence microscopy
荧光显微镜 Fluorescence microscopy 荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统等组成。 广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、定性观察及分析。

30 Fluorescence microscopy
荧光显微镜 Fluorescence microscopy 参加过仪器使用培训，通过 网上仪器知识考试，网上提 前预约，管理员审核通过方 可使用。 注意事项： 汞灯使用时尽量减少启动次数；灯熄灭后要等待冷却才能重新启动；点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min 放置地点 ： 室 管理员：吴安庆老师 仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜

31 显微镜参数 1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置；
3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×（数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、40×（N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可重现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；

32 显微镜参数 7．荧光照明器：主机反射荧光系统可采用复眼照明技术，平均荧光视野亮度，便于量化分析；
8. 荧光光源：130W以上长寿命荧光光源, 光导管传输，长度1.5米，符合RoHS 和WEEE法令要求； 9. 高通透性荧光激发块：紫外， BP , DM410，BA420-IF 蓝色，BP , DM505，BA510-IF 绿色，BP , DM570，BA575-IF； 10．荧光激发块转盘：编码型荧光激发块转盘，≥7孔位设计，便于今后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存荧光滤色镜组信息； 11．滤色镜：透射用日光平衡滤色片、绿色滤色片，荧光用减光片ND6/ND25； 12．DIC附件：40X、60X物镜配置微分干涉附件。

33 基本原理 高压汞灯 被荧光探针染色的生物样本 被标记结构的荧光光学图像 紫外 蓝 绿 激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
成像 滤镜 分光 激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。 （一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片） 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490 双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 多为长通滤色镜；LP490   荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W）或者高功率LED光源，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。滤片系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤片、二向色性滤光片、发射滤片组成。激发滤片位于光源和标本之间，允许特定波长范围的光通过，作为样品的激发光。发射滤片位于物镜和目镜之间，允许标本发射的荧光通过，以获得清晰的图像。二向色性滤光片在激发滤片和发射滤片之间，是一种入射角为45º的干涉滤光片，它可以反射一定波长的光同时透过另外波长范围的光线 1

34 标本制作要求 （一）载玻片 　　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面 不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时 需用石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片 　　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。 　　（三）标本 　　组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜 直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 　　（四）封裱剂 　　封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等 量混合液作封裱剂。 　　（五）镜油 　　一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。

35 荧光显微镜的不足: 1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.只能在二维环境下观察。 6.样品不能太厚。

36 激光共聚焦扫描显微镜  以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）  以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统 激光共聚焦显微镜原理：它是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。 同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具.精确地对光谱的本质进行分析，区分发射光谱高度重叠的不同标记的信号。 最重要的是，对于多色的荧光染色，它能彻底消除了荧光串色的影响，同时最大限度的减少了样品荧光信号的损失。这些都是一般光镜所不能达到的。 1

37 激光共聚焦扫描显微镜 OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜
参加过仪器使用培训，通过网上仪器 知识考试，网上提前预约，管理员审核 通过方可使用。 注意事项： 1、开机和关机需要管理员来操作 2、换样本的时候需要将物镜降下来， 或点击软件上Escape 3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样 本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器 寿命。 激光共聚焦显微镜原理：它是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。 同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具.精确地对光谱的本质进行分析，区分发射光谱高度重叠的不同标记的信号。 最重要的是，对于多色的荧光染色，它能彻底消除了荧光串色的影响，同时最大限度的减少了样品荧光信号的损失。这些都是一般光镜所不能达到的。 放置地点： 室 管理员：吴安庆老师 收费：200元/小时 1

38 上转换共聚焦扫描显微镜 OLYMPUS FV1200 放置地点：401-1111 管理员：吴艳 普通共聚焦：400元/小时
上转换共聚焦：1000元/小时 院内5折，校内8 折 只允许3天后15天内的预约 多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm 活细胞CO2培养系统 普通激光共聚焦显微镜的功能 上转换材料的成像检测

39 仪器参数 IX83 针孔光栏 分光镜 发射荧光单色器及检测器 计算机图像存储与处理及控制系统
多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm

40 仪器参数

41 仪器参数

42 仪器参数

43 基本原理 用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。

44 仪器特点 1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。
1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。 2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。 （色差是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像模糊,而且像的边缘尚带有色晕） （ 球差是由于透镜不能把近轴光线和远轴光线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不清。）

45 仪器特点 样品 入射光 发射光 滤光片 激光器 长通滤光片 扩光器 针孔 检测器
只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。 针孔 检测器 1

46 仪器特点 样品 入射光 发射光 滤光片 激光器 长通滤光片 扩光器 针孔 检测器 1

47 仪器特点 样品 入射光 发射光 滤光片 激光器 长通滤光片 扩光器 针孔 检测器

48 仪器特点 3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。 4、图像信号及处理： 光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。 普通光镜：是在可见光源下一次性成像

49 激光共聚焦显微镜的优势 更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。 定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 快速性： 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。

50 激光共聚焦显微镜的样本 石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、 铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，各 种染色，非染色荧光标记的组织（包括 活组织）

51 共聚焦显微镜的应用 高清晰成像 半定量荧光强度分析 荧光探针表达量测定 分层扫描 多种荧光标记同时检测

52 1、高清晰成像 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。 可以清晰的表现某些细微结构。

53 高清晰成像 鼠成纤维细胞 单克隆anti–β-tubulin标记

54 高清晰成像 涡虫纲扁虫肌动蛋白丝 鬼笔环肽

55 高清晰成像 培养的人肝癌细胞吖叮橙染色

56 2、半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 随机圈取细胞
可得到所圈细胞的相对荧光强度值 1

57 3、荧光标记表达量测定 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。

58 4、分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。

59 4、分层扫描（切片扫描） 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。

60 4、分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。

61 5、多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子 肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst ，染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白

62 常用荧光探针介绍 细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针

63 细胞活性探针 活细胞探针：吖叮橙（AO） 是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。
死细胞探针：碘化丙锭（PI） 膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合

64 细胞器探针 线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。
溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。 但现在尚无一种理想的内质网特异性探针，因此类燃料内内质网和其他细胞器同样着色，必要时可用内质网特异蛋白抗体。） 1

65 细胞骨架探针 F-肌动蛋白荧光探针： 鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记

66 核酸探针 吖叮橙（AO） 与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色
Hoechst 与DNA结合，分辨率高 DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。

67 谢 谢！