安徽省细菌耐药监控中心 安徽医科大学临床检验诊断学教研室 安徽医科大学第一附属医院检验科 徐元宏

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1 安徽省细菌耐药监控中心 安徽医科大学临床检验诊断学教研室 安徽医科大学第一附属医院检验科 徐元宏
细菌药敏试验及耐药机制研究进展 安徽省细菌耐药监控中心 安徽医科大学临床检验诊断学教研室 安徽医科大学第一附属医院检验科 徐元宏

2 一、药敏试验种类 1、 纸片扩散法 2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法

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4 细菌药敏试验-宏量稀释法 Minimal inhibitory concentration (MIC)
Reference method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic. Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by agar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels 104 cfu 4 2 1 0.5 0.25 0.12 mg/ml

5 微量液体稀释法

6 细菌药敏试验- E-test法 E-test
Strips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip. Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.

7 二、药敏试验基本条件

8 （1）对于从粪便中分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试和报告氨苄西林，一种喹酮类药和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。此外对于胃肠外分离的沙门菌属还一定要测试并报告氯霉素及其某一种Ⅲ代头孢菌素的结果。
（2）所有确认产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类，头孢菌素类和氨曲南。 （3）出于对流行性，治疗及感染控制方面的考虑，应该把从尿中分离的所有菌株做ESBLs 筛选试验作为一个基本制度。 （4）仅当被认为与临床有关时（如菌血症）才进行奇异变形杆菌ESBLs筛选试验 （5）肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和沙雷菌属可发展为耐药。最初分离的敏感菌株在开始治疗3~4天内可变为耐药，因此对重复分离菌株应重新进行药敏试验。 。

9 用纸片扩散法能可靠地测定分离于囊性纤维化病人的铜绿假单菌的敏感性，但在作为敏感结果报告前，应将孵育时间延长至24小时。

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19 （1）对于肠球菌属，头孢菌素，氨基糖苷类（筛选高水平耐药除外），克林霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑可以在体外显示活性但临床上无效，因此这些菌株不应该报告为敏感。
（2）肠球菌心内膜炎要求大剂量青霉素或氨苄西林，或万古霉素或替考拉宁联合庆大霉素或链霉素以增加杀菌作用。

20 （3）庆大霉素和链霉素筛选试验，能够预测氨苄西林、青霉素或万古霉素与一种氨基糖苷类抗生素之间的协同效应。其它的氨基糖苷类不需进行测试，因为它们对肠球菌的活性并不优于庆大霉素和链霉素。
（4）对血和脑脊液分离株推荐用头孢硝噻吩β-内酰胺酶试验。β-内酰胺酶试验阳性提示青霉素耐药，同时也对酰胺基，羧基和脲基青霉素耐药。

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23 （1）肺炎链球菌对苯唑西林的抑菌环≥20mm的菌株对青霉素敏感(MIC≤0.06μg/ml)
（2）苯唑西林的抑菌环≤19mm的菌株应当测定青霉素、美洛培南和头孢噻肟或头孢曲松的MICs

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35 三、耐药表型的检验 1、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌中ESBLs检测的筛选与确证试验 纸片法 ：初筛和确证
液体稀释法：初筛和确证

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42 3.D试验-克林霉素诱导耐药试验 （1）机制：对大环内酯耐药的葡萄球菌可能有天然或诱导性对克林霉素的耐药[通过erm 基因编码的23S rRNA 甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B 型链阳霉素）耐药]，或只对大环内酯类耐药（由msrA 基因编码的外排机制）。 （2）方法：MHA或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15μg/片）边缘15~26mm 处放置克林霉素纸片(2μg/片)来进行检测；对于β-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2μg/片)和红霉素纸片（15μg/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。

43 （3）结果判读：35℃空气，16-20小时孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。

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45 葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药机制研究：
一、由msrA基因介导的主动外排机制，即M型耐药； 二、抗生素作用靶位的改变，即由erm基因编码的RNA甲基化酶对细菌核糖体50S亚基23SrRNA进行特定核苷酸残基甲基化，使药物与靶位的结合能力下降，导致对具有相同靶位的大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B三类药物同时耐药，临床称为MLS型耐药。体外药敏试验又可将MLS型分为结构型（cMLS型）和诱导型（iMLS型）；cMLS型为红霉素和克林霉素均耐药；iMLS型红霉素耐药、克林霉素敏感。

46 4. 肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药检测 （1）肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药液体稀释法琼脂稀释法、筛选试验

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49 谢谢！