第七章 细胞培养技术和培养箱 cell culture and incubate

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1 第七章 细胞培养技术和培养箱 cell culture and incubate

2 本章目录 第一节 细胞培养技术的基本原理 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法
第一节 细胞培养技术的基本原理 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 第五节 培养箱的进展

3 第一节 细胞培养技术的基本原理 细胞培养（cell culture）也称为组织培养（tissue culture），是从生物体内取出组织或细胞，在试管和培养平皿内模拟体内生理环境，于无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究。

4 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 根据体外培养细胞能否贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。大多数培养细胞为贴附型，多呈上皮样或成纤维细胞样，具有接触抑制和密度抑制的特性。少数细胞在培养时以悬浮状态生长（包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞）。

5 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 贴附细胞型MRC-5成纤维细胞

6 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞

7 Molt4细胞悬浮2～3天的细胞图片 (成人T淋巴细胞白血病细胞株)
第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 Molt4细胞悬浮2～3天的细胞图片 (成人T淋巴细胞白血病细胞株)

8 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 悬浮型培养细胞

9 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 传代（passage 或subculture）当细胞增殖至一定密度后，由于培养细胞的孤立生存环境和有限的营养，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，使细胞增殖继续过程。 一代 从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间。细胞培养一代的过程中，一般细胞可倍增2～6次。

10 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 原代细胞培养 从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。 次代细胞培养 将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，收集洗涤，再分装至含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养，形成的单层细胞。

11 第二节 培养细胞的类型、特点及增殖过程 细胞系（cell line） 原代细胞一经传代后细胞。 无限细胞系或连续细胞系 细胞获得永生性即永久增殖的能力。

12 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 培养细胞的生存条件 营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等
第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 培养细胞的生存条件 培养皿 或培养瓶 营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等 温度、湿度和气体由CO2恒温孵育箱提供 维持 培养液 2％～5％ 的血清 生长 培养液 10％～20％ 的血清

13 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 培养设备

14 技术方法 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞分离 消化法传代 细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养
第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 技术方法 细胞分离 原代（初代）培养 消化法传代 细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养 组织块剪切,消化法使组织进一步分散 将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，收集洗涤，再分装至 含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养 制备获得细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养

15 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞的冻存和复苏-“慢冻快融”
第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞的冻存和复苏-“慢冻快融” 冻存 选用对数生长期细胞，用常规方法收集按（1～5）×106/ml细胞浓度，悬浮于含10％DMSO或甘油的含血清培养液中，分装，封口，放入纱布小袋中。可用手工方法从把冻存管悬在液氮容器口开始，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。或先将冻存管移入液氮罐口颈部气相中过夜，次日将纱布袋缓慢下降至液氮中，历时3min。在液氮中可长期保存。 复苏 将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37 ℃ ～40℃水浴中使其在1min内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，500～1000rpm低速离心5min，去上清，加入新鲜培养液适量，转入培养瓶中置37℃培养。

16 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞培养微生物污染的检测 霉菌污染后，一般肉眼可见在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，短期内培养液多不混浊；倒置显微镜下可见于细胞之间悬浮飘荡在培养液中的纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；或可见散在细胞周边和细胞之间的卵圆形单细胞真菌。

17 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞培养微生物污染的检测
第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞培养微生物污染的检测 支原体污染可做如下检测：①相差显微镜检测， 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；②荧光染色法，用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258使支原体DNA着色，置荧光显微镜下观察，可见散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点为支原体污染；③电镜检测，用扫描电镜或透射电镜观察支原体；④DNA分子杂交检测或支原体培养等方法，检出率高，但方法较复杂。 细菌污染后，由于大量酸性物质产生，培养液短期内颜色变黄并出现明显混浊现象；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。

18 第三节 培养细胞的生存条件及技术方法 细胞培养应用 临床肿瘤 诊断 临床病原学 诊断 细胞融合 组织工程 核移植 基因转移 细胞治疗

19 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
一、电热恒温培养箱 二、二氧化碳培养箱 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 三、厌氧培养箱

20 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 电热恒温培养箱 电热恒温培养箱适合于普通的细菌培养和封闭式细胞培养，并常用于有关细胞培养的器材和试剂的预温及恒定。 电热恒温培养箱有隔水式电热恒温培养箱和气套式电热恒温培养箱两种，两者基本结构相似，只是加热方式不同，前者的温度变化幅度比后者小，因而在使用上更具有优势。 气套式电热恒温培养箱

21 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 恒温培养箱 恒温培养箱为优质钢板制造的立式箱体，内门用钢化玻璃制成。无需打开内门观察箱内物品有利于保温。工作室由双层不锈钢亚弧焊接制成，里面一般放置23层用于承托培养物的不锈钢搁板，工作室和钢化玻璃内门之间装有硅橡胶密封圈，工作室外壁左、右和底部通过隔水套加热，工作室顶装有一只低噪声小型风机，以保证箱内温度均匀,水套上部设有溢水口直通箱体底部，并有低水位报警功能。气套式采用空气循环加热方式，加热组件环绕培养箱的所有外夹套，可以均匀加热。箱体外壳和工作室外壁填充硬质聚胺酯隔热。电源开关和电源指示灯、微电脑智能控温仪均设置在培养箱上部，微电脑智能控温仪采用自整定PID技术，

22 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 电热恒温培养箱使用与注意事项 恒温培养箱使用步骤 隔水层的加水 温度设定 温度显示值修正 上限跟踪报警设定 控温仪的PID自整定控制

23 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 隔水层的加水 第一次使用时，打开水龙头低水位指示灯亮且伴有报警声，当水位逐渐升高，低水位指示灯灭报警声消失时，应及时关闭水龙头。若溢水口有水溢出时,应把放水塞头拔出放水，同时观察溢水口，没有水溢出时应立即将塞头塞紧。直至低水位无声、无报警、没水溢出。

24 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 智能控温仪的温度设定 按控温仪的功能键“SET”进入温度设定状态，再按移位键配合加键或减键，设定结束需按功能键“SET”确认。设定结束后培养箱进入升温状态，加热指示灯亮。当箱内温度接近设定温度时，加热指示灯反复多次忽亮忽熄，控制进入恒温状态。

25 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养

26 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 二氧化碳培养箱 培养箱的结构 以水套式CO2培养箱为例，培养箱基本有三壁结构箱体、控制中心（包括键盘、显示器、指示器等）、CO2/O2传感器、增湿盘等。 二氧化碳培养箱（培养箱）提供箱内一定浓度二氧化碳气体和相对湿度，创造了细胞与微生物正常生命活动的环境条件，使之在脱离复杂机体内环境的直接影响，在体外能生长繁殖。

27 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 控制中心（包括键盘、显示器、指示器等） 二氧化碳培养箱

28 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 培养箱的分类、结构特点和使用 水套式CO2培养箱 可分为单\双内舱水套培养箱两种。 箱内传感器有热传导(T/C）和红外（IR）传感器两种。 水套注入口(用于注满水)。 水套排气口（在水套注满过程中或热胀冷缩时让空气逸出，不能覆盖）。 水套水排口（用于迅速排空水套）。 加热式内门（为了保持箱内干燥）。 箱内气体取样口（可使用Fyrite或类似工具提取箱内样本的含量）。

29 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 二氧化碳培养箱的结构

30 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 水套式培养箱四个基本模式设置（运行、设置、校正、系统配置） 运行模式-默认模式 设定模式-温度、超温、和浓度设置 系统配置-允许用户设置变化的选件 （包括可听、存取代码、低温警报、高温警报、温度继电器、浓度过低警报、浓度过高警报、RH过低警报、RH继电器、O2浓度过低警报、浓度过高警报、继电器、显示1设置、显示2设置、补偿、RS485登址、气体保护器设置、门加热等） 校正模式-变化系统参数直至用户满意为止，包括温度偏移、零点、CO2浓度范围、浓度范围、相对湿度（RH）偏移等

31 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 气套式培养箱 结构特点： ①直接加热，加热组件环绕所有外夹套，能均匀加热并用玻璃纤维绝缘包绕； ②箱体不需注水、排水，无溢出或缺水警报； ③取样口处于箱体的前部； ④与水套式相比重量减轻； ⑤采用过温保护系统，当温度过高可自动切断电源。

32 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 结构特点： ⑥可选配HEPA过滤系统，箱体内气体每分钟被过滤一次，快速达到100级气体质量，能为细胞提供理想环境。气套式培养箱的温度范围是（室温+5℃）~50℃，箱内的传感器亦分为热传导（T/C）传感器和红外（IR）传感器两种。当箱内温度和湿度相对稳定时，选用T/C控制；当箱内温度和湿度水平频繁波动时，选用IR控制。

33 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 高温灭菌培养箱 双重灭菌功能，即24小时持续灭菌和不定期高温灭菌。高温灭菌温度为140℃，可除去霉菌、酵母等各类真菌以及各类细菌。24小时持续灭菌是指培养箱采用的气体HEPA过滤系统。不定期高温灭菌是根据实验的需要而进行的高温消毒循环过程。高温消毒循环过程大约需要12小时，可利用夜间灭菌而不影响第二天实验的进度，通过采用最优化的温度与流程，可以减少加热对培养箱的损伤，具有高效、快速、简便的特点。

34 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养

35 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养

36 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养

37 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 厌氧培养箱 称厌氧培养系统（Anaerobic System），是目前国际上公认的厌氧菌培养的最佳设备。操作者可以通过培养箱前面附带的橡胶手套在箱内进行操作，使厌氧菌的接种、培养和鉴定等全部工作都在无氧的环境下进行，因而提高了厌氧菌的阳性检出率。

38 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 厌氧培养箱

39 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 箱内的厌氧状态产生原理 自动连续循环换气系统

40 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养

41 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 催化除氧系统 (厌氧菌最佳生长气体条件85%N2、5%CO2和10%H2) 箱内的厌氧状态产生原理

42 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 大容量细胞培养箱 (可容纳一个七层高的共可放35个培养瓶的细胞转瓶机)

43 第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养
第四节 培养箱的分类、结构、使用及维护保养 细胞转瓶机，水平摇床

44 第五节 培养箱的进展 随着集成电路、材料结构等相关技术的发展，新的制造工艺不断被应用于培养箱的制作，但价格也变得昂贵，所以不同实验室应根据各自的能力和目的，选择相应的培养箱，达到科研和临床检测的目的。