制药用水生物指标检测 药友 陈彦.

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1 制药用水生物指标检测 药友 陈彦

2 主要内容 制药用水质量控制简介 3 1 注射用水细菌内毒素检测 2 注射用水微生物限度检测 3

3 制药用水的简介 水是药物生产中用量最大、使用最广的一种辅料，用于生产过程及药物制剂的制备。

4 1.电解质（可通过电导率测量） 制备成为制药用水，水中需要去除的物质有： 2.有机物（可用总有机碳（TOC）测定仪测量） 3.颗粒物质
4.微生物（培养法或者薄膜过滤法） 5.溶解的气体

5 2010版中国药典中所收载的制药用水，因其使用的范围不同而分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。

6 饮用水 饮用水：为天然水经净化处理所得的水，其质量必须符合现行中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》。
饮用水可作为药材净制时的漂洗、制药用具的粗洗用水。除另有规定外，也可作为饮片的提取溶剂。 （2010版中国药典） 检测指标： ☆微生物指标（微生物限度、大肠埃希菌） ☆感官性状和一般化学指标（色、浑浊度、 臭和味、肉眼可见物、pH值） ☆消毒剂常规指标（游离余氯）

7 纯化水 纯化水：为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制备的制药用水。不含任何附加剂，其质量应符合纯化水项下的规定。
纯化水可作为配制普通药物制剂用或试验用水；可作为中药注射剂、滴眼剂等灭菌制剂所用饮片的提取溶剂；口服、外用制剂配制用溶剂或稀释剂；非灭菌制剂用器具的精洗用水。也可用作非灭菌制剂所用饮片的提取溶剂。纯化水不得用于注射剂的配制与稀释。（2010版中国药典）

8 纯化水 ☆性状 ☆酸碱度 2010版药典检测指标： ☆硝酸盐 ☆亚硝酸盐 ☆氨 ☆电导率 ☆总有机碳 ☆不挥发物 ☆重金属 ☆微生物限度
☆性状 ☆酸碱度 ☆硝酸盐 ☆亚硝酸盐 ☆氨 ☆电导率 ☆总有机碳 ☆不挥发物 ☆重金属 ☆微生物限度 与2005年版药典相比，增加了电导率和总有机碳的要求，取消了氯化物 、硫酸盐与钙盐的检验项目。

9 注射用水 注射用水： 为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素试验要求。注射用水必须在防止细菌内毒素产生的设计条件下生产、贮藏及分装。其质量应符合注射用水项下的规定。 注射用水可作为配制注射剂、滴眼剂等的溶剂或稀释剂及容器的精洗。 （2010版中国药典）

10 注射用水 ☆性状 ☆pH值 ☆氨 2010版药典检测指标： ☆硝酸盐 ☆亚硝酸盐 ☆电导率 ☆总有机碳 ☆不挥发物 ☆重金属
☆硝酸盐 ☆亚硝酸盐 ☆电导率 ☆总有机碳 ☆不挥发物 ☆重金属 ☆细菌内毒素 ☆微生物限度 与2005年版相比，增加了电导率和总有机碳的要求

11 灭菌注射用水 灭菌注射用水：为注射用水按照注射剂生产工艺制备所得，不含任何添加剂。主要用于注射用灭菌粉末的溶剂或注射剂的稀释剂。其质量应符合灭菌注射用水项下的规定。 2010版药典检测指标： ☆性状 ☆pH值 ☆氯化物、硫酸盐与钙盐 ☆二氧化碳 ☆氨 ☆硝酸盐 ☆亚硝酸盐 ☆电导率 ☆易氧化物 ☆不挥发物 ☆重金属 ☆细菌内毒素 ☆其他（应符合注射剂项下有关的各项规定）

12 2010中国药典关于制药用水的质量标准，除适当减
少了某些化学检查项外，主要是增加了两项检查： ⑴ 电导率检查：用于监测各种阴阳离子的污染程度 ⑵ 总有机碳检查：用于监测有机污染 上述两项的在线检测可对制水系统进行实时流程监控

13 二级反渗透纯化水制备系统

14 多效蒸馏水机

15 纯化水、注射用水在线电导率监测

16 在线TOC监测

17 制药用水设备流程图 原水 砂滤 碳滤 去离子装置 一级反渗透 二级反渗透 多效蒸馏塔 纯蒸汽发生装置 纯化水储罐 注射用水储罐 纯蒸汽输气管
生产装置 砂滤 碳滤 去离子装置 一级反渗透 注射用水生产装置 纯蒸汽发生装置 二级反渗透 多效蒸馏塔 纯蒸汽发生装置 注射用水供应装置 纯蒸汽供应装置 纯化水 供应装置 纯化水储罐 注射用水储罐 纯蒸汽输气管 纯化水 用水点 注射用水 用水点 纯蒸汽 用气点

18 制药用水系统的日常管理 水系统验证： 用户要求说明（URS） 设计确认（DQ） 安装确认（IQ） 运行确认（OQ） 性能确认（PQ）
分三阶段进行: 第一阶段： 2-4周（高密度取样检测） 第二阶段： 2-4周（高密度取样检测） 第三阶段：持续一年（常规取样模式）

19 PQ阶段1 .用2 ~ 4 周的测试密集监控系统。在这个阶段系统应该是能够无故障、无性能偏差的连续运行。应该包括下列内容：
• 按预定计划进行化学和生物测试。 • 每日在总供水点取样，确认其质量。 • 每日在每个纯化工艺步骤后的位置取样。 • 每日在每个用水点和其他设定的取样点取样。 • 确定适当的运行范围。 • 形成和确定运行、清洁、消毒和维护规程。 • 证明系统能按质按量完成生产和分配。 • 使用并完善标准操作程序（S O P s )用于运行、维护、 消毒和故障排除。 • 核实临时的警戒限和行动限。 • 制定和完善超标检测结果处理规程。

20 警戒限和行动限的建立原则

21 PQ阶段2 . 在阶段1 圆满完成后，将继续进行一个2 ~ 4 周的强化监控。取样安排与阶段1 一致。在这个阶段的水可以用于生产用途。此阶段步骤注重于：
• 证明系统在已确定范围内能稳定运行。 • 证明系统按照SOPs运行，能保证水的制备和分配都符合要求。 PQ阶段3 . 阶段3 通常在圆满地完成阶段2 后运行一年。此阶段的水可以用于生产用途。此阶段的目的是： • 证明系统性能长期可靠。 • 确保季节性的因素得到评估。 • 取样的位置、取样频率和测试可以基于阶段1 和阶段2 制定的程序和检测结果，简化到正常监测模式。

22 饮用水推荐日常监测频率 纯化水及注射用水推荐日常监测频率

23 应使用与PQ第三阶段相似的频率对系统进行日常监测 制药用水系统取样
制药用水系统的持续监测 应使用与PQ第三阶段相似的频率对系统进行日常监测 制药用水系统取样 取样基本要求： • 全部监控取样点统一编号，不得有重复编号，以免发生混淆。 • 取样时的冲洗时间须于生产使用水时冲洗时间相一致。 • 如果生产中使用软管取水，取样应通过相同或相类似的软管取样。 • 取样时取样口应喷消毒液消毒，并放掉一定量水后，润洗取样瓶后迅速取样并将容器密封。 • 取样后及时检测。 • 如取样中使用软管，用后要及时取下，排净管中的水。

24 制药用水使用点示例

25 取样器具示例 微生物检查用：500ml已灭菌的带盖红盖试剂瓶 细菌内毒素检查用：7ml去热原的注射剂瓶
TOC检查用：40ml仪器配备的专用瓶

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27 制药用水的质量指标构成 化学指标： 进行纯化的各阶段决定 生物指标： 更注重从设计到运行和监测的整个过程

28 水系统微生物污染的来源 原料水 外源性污染 内源性污染

29 外源性污染 外源性污染主要指来自于水系统外部的原 因对系统造成的污染，例如： 系统未与外界空气隔绝 倒流污染，如出水口污染后发生倒流
管道的连接泄漏 储罐上的呼吸口未使用过滤器 过滤器泄漏 倒流污染，如出水口污染后发生倒流 维护和维修后，如更换活性炭和树脂的颗粒残留

30 内源性污染 内源性污染是指水系统的各设备单元本身 造成的微生物污染。 设备对微生物的吸附并形成生物膜，如活性炭，离子交换树脂，过滤器膜等
配水管道的内表面、阀门等附着微生物

31 水系统的有机物污染控制 有机污染物 去除方法 污染的预防 ◆细菌污染 ◆热原污染 ◆总有机碳不溶的有机化合物 ◆臭氧 ◆离子交换 ◆碳滤
◆超滤 ◆反渗透 ◆定期消毒 污染的预防 ◆设计建造 ◆日常运行

32 制药用水生物指标质量标准 注射用水：（2010版中国药典） 细菌内毒素 限度为每1ml中含内毒素量应小于 0.25EU
法处理后，依法检查，细菌、霉菌 和酵母菌总数每100ml不得过10个 纯化水： （2010版中国药典） 微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后， 依法检查，细菌、霉菌和酵母菌总 数每1ml不得过100个

33 注射用水细菌内毒素检测 细菌内毒素 是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原物质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A。 脂多糖 LPS 寡糖重复 单位 核心多糖 脂质A 外膜 主要毒性成份 O抗原决定簇

34 G-菌中内毒素位置

35 内毒素的危害： 内毒素能够直接作用于人体，激活组织内的炎性细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎症反应，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状，严重时甚至危及生命。

36 内毒素的特点 无处不在 体积小 水溶性 耐热性 不挥发性 化学稳定性强

37 原理 内毒素的检测方法 器具的处理 供试品内毒素的检测

38 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素检查包括： 限量实验 凝胶法 半定量实验 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 浊度法 动态浊度法 光度测定法 终点浊度法 显色基质法 动态显色法 终点显色法

39 内毒素凝胶法原理： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎或美洲鲎变形细胞溶解物的冷冻干燥品，内含能被微量细菌内毒素激活的凝胶酶原和凝固蛋白原。在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质），细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。凝胶法是根据凝集反应所形成凝胶的坚实程度来限量检测细菌内毒素，用以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。

40 内毒素凝胶法实验步骤 器具的准备 经干热灭菌法（250℃30min）以上去除内毒素的玻璃试管

41 超净工作台、漩涡混合器、剪刀、撬盖夹、微量可调移液器、封口胶、定时钟、无热原吸头、试管架、浮板

42 使用试剂：细菌内毒素标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于0.015EU/ml）

43 实验操作 细菌内毒素工作标准品溶液（C液）的制备：开启内毒素标准品（冻干品），加入检查用水1ml溶解后，封口，置漩涡混合器上混匀15min。分步稀释至所需浓度备用，每步稀释后均置漩涡混合器上混匀30s ，稀释为2 λ浓度的内毒素工作标准品溶液即为C液。

44 • 样品溶液为注射用水原液（A液） • 样品对照品溶液（B液）的制备
用移液枪精密吸取1.8ml原液置除热原试管中，再用移液枪精密吸取含有20 λ细菌内毒素工作标准品溶液0.2ml加入到原液中，在漩涡混合器上混合30秒后制成含2.0 λ细菌内毒素工作标准品的样品对照品溶液（B液）。 B液的制备 A液

45 • 取鲎试剂8支，每支分别加入0.1ml细菌内毒素检查用水溶解。
• 取2支各加入A液0.1ml作为供试品管（A管），2支各加入B液0.1ml作为供试品阳性对照管（B管），2支各加入C液0.1ml作为阳性对照管（C管），2支各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管（D管）。

46 •用封口胶封闭鲎试剂安瓿的管口，将试管中溶液轻轻混匀。
•将安瓿插入浮板，把浮板垂直放入37℃±1℃恒温水浴锅中，保温60分钟±2分钟。

47 将插有鲎试剂安瓿的浮板从恒温水浴锅中轻轻取出，将鲎试剂安瓿缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）。凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
坚实凝胶 未形成凝胶 凝胶不坚实 阳性“+” 阴性“—”

48 供试品细菌内毒素检查 结果判断 • 当阳性对照（C管）都为阳性、供试品阳性对照（B管）都为阳性且阴性对照（D管）都为阴性时，实验方有效。
• 供试品管（A管）2支均为(-)，应判定符合规定；如2支均为(+)，应判定不符合规定；如2支中1支为（+），1支为(-)，按上述方法另取4支供试品管复试，4之中1支为（+），即判定不符合规定。 阳性“+” 阴性“—”

49 不合格情况的处理： 如为实验室原因造成， 复验，提供OOS报告 非实验室差错，立即 报告QA进行扩展调查
立即展开OOS（out of specification）调查 如为实验室原因造成， 复验，提供OOS报告 非实验室差错，立即 报告QA进行扩展调查

50 制药用水微生物限度检测 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。（2010版中国药典） 微生物限度试验应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 （2010版中国药典）

51 注射用水微生物限度检测步骤 进入洁净室 刷卡进入微生物限度检测区洁净室换鞋间。

52 进入换鞋间脱下工作鞋，观察洁净区对一般区压差是否符合规定并记录。

53 进入一更间脱下工作服。

54 用液体皂洗手，冲洗干净，吹干，手消毒。

55 进入二更间，手消毒，穿无菌服，戴无菌乳胶手套，手消毒，戴眼罩，再次手消毒。

56 进入微生物检测室，对超净台内部用75%乙醇擦拭消毒后，开启超净台风机30min。

57 样品通过传递柜紫外照射消毒后传入洁净室。

58 点燃超净台内酒精灯。样品用酒精棉球消毒后，传入超净台，再次消毒。

59 在集菌仪上安装好薄膜过滤系统。

60 将吸样针头拿在火焰旁，并在火焰旁小心打开样品瓶盖。

61 开启集菌仪，吸样针头抽取样品，每膜过滤量为100ml，共过滤200ml。

62 过滤完毕后，关闭集菌仪，取下抽滤筒。将镊子前端在火上灼烧，备用。

63 打开抽滤筒，小心取下滤膜。

64 将滤膜集菌面朝上贴于玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌总数检查用）平板上。

65 打开另一滤筒，取下滤膜。将滤膜集菌面朝上贴于营养琼脂培养基（细菌计数检查用）平板上

66 • 平皿通过传递窗传出洁净室，待培养。 • 清洁：用消毒液擦拭超净台，再用清水擦拭干净。用消毒液擦拭墙面，再用清水擦拭干净。用消毒液擦拭地面，再用清水擦拭干净。开启超净台紫外灯。再按进入洁净室相反的顺序退出洁净室。

67 玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌总数检查用）平板，倒置于23—28℃培养箱中培养5天。
营养琼脂培养基（细菌计数检查用）平板，倒置于30—35℃培养箱中培养3天。

68 • 超警戒限即应引起注意，如有再次超警戒限，应立即
结果判断 细菌、霉菌和酵母菌总数每100ml不得过10个 超限处理 • 超警戒限即应引起注意，如有再次超警戒限，应立即 展开调查并采取措施。 • 超行动限，应立即展开调查并采取措施。 • 日常监测发现有非日常水系统中常见菌的可疑菌，应 进行菌种鉴别，不得为致病菌。

69 饮用水控制菌检查 饮用水不得检出大肠埃希菌 检验方法：
• 用灭菌刻度吸管吸取供试液10ml,注入到100ml胆盐乳糖培养基中，置30-35℃培养箱中培养24小时。吸取上述培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基管内进行培养。于5小时、24小时后，将各管置366nm紫外灯下观察有无荧光，同时用空白MUG培养基做本底对照，用加入大肠埃希菌的MUG培养基做阳性对照。 • 如管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。同时在培养24小时后在各管中加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰色为靛基质阳性；呈试剂本色为靛基质阴性。

70 如MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。
结果判断： 如MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。 如MUG、靛基质不同时为阳性或阴性，则取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24小时。 若平板上无菌落生长或生长的菌落与大肠埃希菌菌落特征不符，供试品判未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。 MUG阳性 MUG阴性 靛基质阴性 靛基质阳性

71 菌种鉴别 • 选择性培养基 • 生化试验 • 试剂条鉴定方法 • 微生物自动化分析仪 生物梅里埃 VITEK 2 Compact
自动微生物鉴定仪

72 谢谢！