A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool

Presentation on theme: "A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool"— Presentation transcript:

1 A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool
Journal of immunological method 2009，V349 A method for isolating and analyzing human mRNA from newborn stool 徐振杰 2011,08,24

2 1. Introduction 1. 人类转录组对于人类健康和疾病的研究很有价值； 2. 目前的研究仅限于血液、尿液和软组织；
3. 对于粪便等中的转录子的研究也仅限于成人消化道肿瘤的检测； 4. 目前用于分离人类粪便RNA的方法和试剂未能商业化或者未能去除PCR抑制因子。 本研究发展了Kang的方法，报道了样品间和个体间的mRNA的差异。

3 2. Materials and Methods 三个婴儿，分别是怀孕27周、27周、29周出生的婴儿，收集其新鲜粪便。三步法提取RNA:玻璃珠法+苯酚-氯仿抽提+硅胶柱纯化。 阳性对照组：成人血液白细胞和E.coli，用试剂盒方法提取总RNA。 总RNA得率：分光光度法，表示为RNA的质量/粪便样品的质量；RNA完整性（RIN）用Agilent 5200 Bioanalyzer分析。

4 2. Materials and Methods 逆转录定量PCR：分别用引物扩增IL-6，IL-8，S100A8（钙网蛋白的一个亚基），EGF(表皮生长因子)和GAPDH（管家基因，用于内参）。 PCR抑制因子的检测：用本文方法及其他三种方法提取新生儿粪便中的RNA，以人的白细胞总RNA 或E.coli总RNA为阳性对照，分别用β-肌动蛋白和16S rRNA基因引物PCR扩增，电泳检测。

5 3. Results 3.1 RNA的获得与定量 RNA浓度（RNA质量与粪便质量的比值）较高，完整性较好，RIN达8.6；
比较了4℃和-20℃下储存的样品在0~24h的总RNA得率，显示冷冻4h以内提取最好。 Figure 1

6 3. Results 3.2 样品间的差异 以GAPDH做内参，比较了同一样品的三个等份之间的RNA相对产率，结果发现几乎无明显差异，说明该法重复性好。 Figure 2

7 3. Results 3.3 不同个体之间以及同一个体不同时间之间的差异
以GAPDH做内参，比较了不同个体之间以及同一个体不同时间之间的RNA相对产率，结果发现差异显著。 Figure 3

8 3. Results 比较了三个个体在不同时间GAPDH 的含量。结果显示不同时间之间差异显著。 Figure 4

9 3. Results 3.4 PCR抑制因子 分别用β-肌动蛋白和16S rRNA基因引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。 阳性对照 本文方法
裂解液+ 硅胶柱 玻璃珠+ 硅胶柱 苯酚抽提+乙醇沉淀 Figure 5

10 4. Discussion 1. 尽管患者体内菌群数量也是一个引起变化的重要来源，但是GAPDH随着时间和个体的变化，仍可以作为上皮细胞或炎症细胞在患者体内变化的替代指标。 2. 样品收集后在室温或者4℃放置4 h对于获得完整的RNA是很重要的，可能是由于存在潜伏期。 3. 本研究所选取的几个指标：GAPDH，EGF，IL-6，IL-8，S100A8。

11 4. Discussion 4. 局限性1：研究对象。 5. 局限性2：只考虑了真核。
总之，该三步法可以用于从粪便中获得RNA，快速、得率高、可重复性好、纯度高，几乎无PCR抑制剂。

12 收获： 1. 建立方法时，可重复性和统计分析必不可少； 2. 最好能有对照试验； 3. 证明过程最为重要。

13 谢 谢！ 敬请批评指正！