耳聋基因检测.

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1 耳聋基因检测

2 主要内容 背景介绍 耳聋基因检测的意义 产品介绍 案例分享

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4 什么是耳聋？ 听觉障碍，不能听到外界声响的表现，轻者听而不真，重者不闻外声。 WHO 耳聋分级标准： 级别 表现 纯音听阈 轻度聋
近距离听一般谈话无困难 26～40dB 中度聋 近距离听话感到困难 41～60dB 重度聋 在耳边大声呼喊方能听到 61～80dB 全聋 听不到耳边大声呼喊的声音 超过80dB

5 耳聋分类 耳聋分为传导性耳聋、感音性耳聋、混合性耳聋

6 耳聋的致病因素 遗传因素； 母亲怀孕期间的药物使用史； 孕母宫内感染:如巨细胞病毒、疱疹、毒浆体原虫病； 母亲的生产史；
新生儿高胆红素血症； 颅面部畸形； 早产或体重低； 各种后天因素，如外伤

7 我生育下一个孩子还会耳聋吗？ 常染色体隐性遗传方式：有25%的几率 生育聋儿。 常染色体显性遗传：有50%的几率 生育聋儿。
线粒体母系遗传：母系成员 均会有聋病

8 背景介绍——耳聋发病情况 听力障碍的发病率：新生儿1‰；青年人1%；45-64岁人群14%；65-75岁为30%-60%；75岁以后达50%-70%存在不同程度的听力损失。 中国残疾人联合会公布： 1987年的第一次全国残疾人抽样调查各类残疾人总数约为5164万，其中听力言语残疾为1770万人，占总残疾人总数的34.28%，是各类残疾的首位。 2006年的第二次全国残疾人抽样调查，全国各类残疾人总数为8296万人，听力残疾2004万人占残疾人总数24.16%，位于第二位，仅次于肢体残疾。

9 背景介绍——耳聋发病原因 新生儿听力损失中遗传因素占据了65%的病因
在对四岁及四岁以内的听力损失患儿病因进行分析时，遗传因素所占比例为71%，高于出生时 1、 Fortnum HM，Summerfield AQ，Marshall DH，et a1．Prevalence of permanent childhood hearing impairment in the United Kingdom and implications for universal neonatal hearing screening：questionnaire based ascertainment study[J]．Bmj 2001，323：536． 2、 Kennedy C。McCann D．Universal neonatal hearing screening moving from evidence to practice[J]．Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed．2004．89：F378． 3. Nance WE，Lim BG,Dodson KM．Importance of congenital cytomegalovirus infections as a cause for pre—lingual hearing loss[J]．J Clin Virol，2006，35：221． N Engl J Med, : p

10 背景介绍——流行病学的警示意义 确立了中国聋哑人群常见的3个易感基因及突变热点 药物敏感性耳聋（mtDNA 1555A>G)：
占我国2780万听力残疾者的5-12%,意味着 万人可以通过用药警示而避免致聋。 先天性重度耳聋(GJB2)： 占听力残疾者的20%,意味着556万人可以明确病因，早期发现，早期干预，聋而不“哑”。 大前庭水管综合征(SLC26A4)： 占听力残疾者的16%,意味着445万人通过早期发现可以避免永久性听力损失。 12、韩东一等。1190例非综合征性耳聋患者GJB2序列分析，中华医学杂志，2007年10月30日第87卷第40期。 13、袁永一等。大前庭水管相关SLC26A4基因热点突变区域筛查方案探讨，Chinese Journal of Otology V01．8，No．3，2010

11 背景介绍——干预措施 助听器： 纯音测听，阈值在40～90dB（中度~重度耳聋）都应建议配用。 人工耳蜗移植
目前对于感音神经性重度耳聋的有效治疗方法-人工耳蜗植入手术，20万元/只 适应症： 1）先天性双耳重度-极重度感音性耳聋； 耳蜗移植的最佳时间是：2岁以内（Audiol Neurootol Jul-Aug;9(4):224-33）。 2）语后聋及成年患者有基本语言识别能力及辨音能力且佩戴助听器无效者。 耳蜗移植的最佳时间，不同的研究存在分歧，从1岁以内到2.5岁以内不等。

12 医院 家庭 社会 耳聋基因检测意义 节省财政支出 提高出生缺陷防治水平；同时推进计生、卫生服务水平 分析耳聋基因在当地的流行病学分布
发现的药物敏感性耳聋和迟发性耳聋的个体提高诊断效率，减少漏诊率 医院 家庭 社会 指导婚育。实现优生优育 早发现、早干预，实现聋而不哑

13 产品汇总 遗传性听力损失基因检测-127 非综合征型耳聋基因检测-51 三个耳聋基因高通量测序 单个耳聋基因sanger全测序
4个基因20个位点 非综合征型耳聋基因检测-51 单个耳聋基因sanger全测序 遗传性听力损失基因检测-127 三个耳聋基因高通量测序

14 四个基因20个位点-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术原理
ddCTP ddGTP ddTTP ddATP 单碱基延伸技术 （iPLEX™） G C 利用样品在电场中的飞行时间与分子的质荷比成正比的原理，通过检测样品分子的飞行时间，测得分子量，推知突变位点。 初始引物引入一个10碱基序列目的之一是提高反应退火温度在多重PCR反应中的稳定性。最佳PCR产物的长度是100bp-120bp.延伸产物产物长度严格控制在18-28bp. 基本原理：先设计出特异性引物，扩增出待测位点的核苷酸片段，然后针对待测位点，设计单条特异引物，退火时此引物3ˊ端的碱基刚好与待测位点的前一个碱基结合。在反应体系中还可加入ddNTP 和DNA聚合酶，当某一ddNTP与待测位点碱基互补并结合时，链延伸反应终止。通常PEX法每次只延伸1-2个碱基。通过MALDI-TOF-MS检测引物及其PEX产物可形成2个峰，二者的m/z荷比之差就是该引物延伸碱基的分子量，据此可推知其碱基种类。与PCR技术相比，PEX所需的延伸时间短，合成的片段小（通常《25bp),产生碱基错配的几率低，反应更精确。 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19

15 技术特点 检测位点多：可同时检测20个基因位点； 灵敏度高：能分辨质量差别为1 Da的分子； 准确率高：>99%；
通量大：每天可检测3000份以上； 自动化程度高：检测数据自动分析； 检测周期短：收到样本后5个工作日可出报告。

16 检测基因及位点 突变 基因 GJB2 SLC26A4 (PDS) 12S rRNA GJB3 位点 染色体 表达蛋白 临床表现
35delG、 167delT、 del16、299_300delAT、 235delC 281C>T、 589G>A、 IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、 IVS15+5G>A 1494C>T A>G 538C>T 547G>A 染色体 13q11-12 7q31 mtDNA 1p33-p35 表达蛋白 缝隙连接蛋白Connexin 26 多次跨膜蛋白Pendrin 线粒体功能损失 缝隙连接蛋白Connexin 31 临床表现 常染色体隐性遗传。变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋 常染色体隐性遗传。先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关 氨基糖甙类药物性致聋，无法逆反 常染色体显性遗传。我国本土克隆和鉴定的第一个耳聋致病基因 GJB2基因突变有地域性，在欧美地区发病率比较高的是35delG，而这位点在我国发病率很低；地中海地区发病率比较高的是167delT，而这位点在我国发病率很低；在我国发病率比较高的是235delC。GJB2基因位于13号染色体长臂上，主要与缝隙连接蛋白K离子通道有关，遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现有较大的变异，统一个位点的突变有些人表现为中度耳聋，而有些人表现为重度耳聋。 SLC26A4 (PDS)基因在我国的突变率比较高的突变位点为919-2A>G（IVS7-2A→G），位于7号染色体长臂，主要与多次跨膜蛋白有关，遗传方式为常染色体隐性遗传，临床表现主要为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。

17 适用人群 新生儿 婚前、孕前和产前人群 各种原因不明的耳聋，包括先天性聋 和后天性聋人群 听力正常，但有耳聋家族史的人群

18 复筛(TEOAE/DPOAE )+AABR/ABR 阈值)筛选听力异常
受检人群 基因检测流程 检测医院 初筛TEOAE/DPOAE 结果通过 自愿选择， 知情同意 结果不通过 复筛(TEOAE/DPOAE )+AABR/ABR 阈值)筛选听力异常 采取最少3个采血斑 知情同意、自愿选择 临床检验中心 检测医院确诊 5个工作日 耳聋基因检测 出具确诊报告 出具检测报告 确诊结果正常 确诊结果为突变 随访 检测结果为杂合突变或纯合突变 随访 检测结果正常 干预追踪

19 听力及基因联合筛查的临床实施模式 在家属签署知情同意的情况下，采集分娩的新生儿足跟血，进行听力筛查和耳聋基因检测，主要有以下这四种情况：1、听力筛查和基因检测均通过的情况下，一般只需要进行听力学随诊程序即可（现在通过，只能代表目前的听力是正常的，但是不代表将来不会耳聋，定期进行检查是很有必要的）； 2、听力筛查通过，基因检测不通过的情况下，我们要高度预警，主要是面对两种人群，医生和患者，医生要谨慎患者是迟发性耳聋或药物性耳聋，要警告患者进行注意避免导致耳聋的诱发因素，患者要进行定期听力检测，听力下降时要及时就医； 3、在听力筛查不通过基因通过的情况下，要进行听力血诊断程序，遗传性耳聋只占耳聋的60%，母亲的怀孕疾病史和生产史以及环境都会导致新生儿耳聋； 4、在两种检测均不通过的情况下要进行听力和基因的联合诊断，明确听力损失和基因突变。

20 51个基因+2个位点 适用范围： 1）基因诊断：对于临床表型难以确诊的病例给予分子水平的鉴别诊断；
目标区域捕获、第二代高通量测序 PCR、 第一代测序 适用范围： 1）基因诊断：对于临床表型难以确诊的病例给予分子水平的鉴别诊断； 2）携带者筛查：对于无临床表型的致病突变携带者进行基因筛查； 检测周期：35工作日

21 检测流程 医院就诊 样本采集 DNA提取 文库制备 高通量测序 数据分析 亲属验证 发送报告 检测周期：35个工作日

22 检测基因/位点 疾病 基因 非综合征型耳聋 ACTG1,CCDC50,CDH23,CLDN14,COCH,DFNB31,DFNA5,DFNB59,DIAPH1,ESPN,ESRRB,EYA4,GJB2,GJB3,GJB6,GRHL2,GRXCR1,HGF,KCNQ4,LHFPL5,LOXHD1,LRTOMT,MARVELD2,MIR96,MYH14,MYH9,MYO15A,MYO1A,MYO3A,MYO6,MYO7A,OTOA,OTOF,PCDH15,POU3F4,POU4F3,PRPS1,RDX,SIX1,SLC17A8,SLC26A4,SLC26A5,STRC,TECTA,TMC1,TMIE,TMPRSS3,TPRN,TRIOBP,USH1C,WFS1,m.1555A>G,m.1494C>T 综合征型耳聋 基因 Waardenburg（瓦登伯格）综合征 EDN3,EDNRB,MITF,PAX3,SNAI2,SOX10 遗传性共济失调性多发性神经炎样病（Refsum综合征） PEX1,PEX2,PEX26 尤塞氏综合征 （Usher syndrome） CDH23,CLRN1,GPR98,USH2A Mohr-Tranebjaerg综合征 TIMM8A 特雷彻-柯林斯综合征 （Treacher Collins syndrome） TCOF1 Alport综合征（遗传性肾炎） COL4A3,COL4A4,COL4A5 Wolfram综合征1型 WFS1

23 单个耳聋基因全测序 检测基因 GJB2 GJB3 SLC26A4 测序采用sanger法，在以下情况可建议进行单个基因全测序
1）耳聋患者检测某个耳聋基因杂合子突变，为明确病因做该基因的全测序 2）若胎儿母亲为某个耳聋基因的携带者，为了评估胎儿患有耳聋的风险，对父亲做该耳聋基因的全测序。

24 遗传因素的具体分析 先天性耳聋（1/1000~3/1000） 遗传因素 （65%） 综合征型（SHL） （30%）
遗传因素 （65%） 综合征型（SHL） （30%） 非综合征型(NSHL)（70%） 常染色体隐性（75~85%） GJB2/DFNB1（50%） 其他DFNB（50%） 常染色体显性（15~24%） X-连锁 （1~2%） 非遗传因素（35%）

25 遗传性耳聋基因检测内容 临床服务：127个基因（重复11个基因） 疾病分类 疾病中类 基因数目 非综合征型（72个基因） 常染色体隐性
45 常染色体显性 28 X-连锁 3 大前庭水管综合征 听神经病 4 综合征型 （66个基因） 伴外耳畸形 11 伴眼病 17 伴代谢性疾病 2 伴肌肉骨骼异常 10 伴泌尿生殖疾病 6 伴内分泌疾病 伴皮肤疾病 伴神经病变 伴心脏缺陷 线粒体遗传性听力损失 - 5 临床服务：127个基因（重复11个基因）

26 遗传性耳聋基因检测技术 目标区域捕获测序 技术简介：采用新一代高通量测序技术，对受检者的耳聋相关基因区域进行检测和分析。

27 服务流程 检测时间：35个工作日（7周） 检测样本：全血：5ml，EDTA抗凝 (紫盖)； DNA：6ug，OD在1.7-2.0，未降解
运输条件：冰袋+干冰运输 检测结果：形成报告文件 样本处理 样本检测 数据分析 报告发送 血样接收 解读咨询 27 27

28 适用条件 主要适用于以下情况： 1：通过热点突变检测未能发现致病原因的耳聋患者 2：非综合征型耳聋，无法确定致病基因及遗传方式的 3：综合征型耳聋患者 4：存在耳聋家族史的人群

29 筛查案例 一家9口人，6人是耳聋 万事必有因，新生儿听力与基因联合筛查这一理念的诞生，在很大程度上与 佛山家系为3代遗传的耳聋家系，现有家系成员9人，其中6名为耳聋患者，除由于婚姻关系成为该家系成员的2名耳聋患者外，剩余的4名患者均为母系家庭成员。

30 家系基因 祖父 杂合突变 祖母 杂合突变 外婆 同质突变 外公 正常 姨妈 同质突变 母亲重聋 同质突变 父亲重聋 纯和突变 叔叔 纯和突变
GJB2 235delc 12SrRNA A1555G 祖父 杂合突变 祖母 杂合突变 外婆 同质突变 外公 正常 姨妈 同质突变 母亲重聋 同质突变 父亲重聋 纯和突变 叔叔 纯和突变 女：1555A纯和 delc杂合

31 启示 非常值得警惕的是：这个孩子通过了听力筛查，如果没有做基因筛查，一旦误用了氨基糖苷类药物将一针致聋，导致严重后果

32 临床案例 患儿杜某，女，11岁； 自述4岁左右，“感冒”后出现耳聋症状； 临床诊断：大前庭水管综合征； 否认孕期病毒感染及耳聋家族史；
检测结果： 患儿：SLC26A4基因1174A>T+2168A>G复合突变； 患儿父亲： SLC26A4基因1174A>T杂合突变； 患儿母亲： SLC26A4基因2168A>G杂合突变。

33 临床案例 患儿 父亲 母亲 A T G SLC26A4基因1174A>T杂合突变 SLC26A4基因2168A>G杂合突变
1174A>T+2168A>G复合突变

34 ？ 指导婚育案例 客户为待孕女士，与前夫生了一个耳聋孩子，组成新的家庭后担心是否还会生一个耳聋的孩子，特来做孕前基因诊断
先证者127个基因检测 母亲突变基因的sanger检测 丈夫突变基因的sanger检测

35 谢谢您的聆听！