第十章 甾体激素类药物的分析 返回主目录.

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1 第十章 甾体激素类药物的分析 返回主目录

2 2008北京奥运兴奋剂检查数量4500例，阳性9例

3 基 本 要 求 1．掌握本类药物常用的鉴别试验和特殊杂质的检查方法。
2．掌握高效液相色谱法、紫外分光光度法、四氮唑比色法、异烟肼比色法、Kober反应比色法等含量测定方法。 3．熟悉本类药物的化学结构、特征官能团与分析方法的关系。 返 回

4 概述 18 12 17 11 19 13 C D 16 1 2 14 9 10 15 8 A B 3 7 5 4 6 基本结构：环戊烷骈多氢菲

5 分类： 肾上腺皮质激素 雄性激素及蛋白同化激素 甾体激素 性激素 孕激素 雌激素

6 C17–醇酮基 肾上腺皮质激素 氢化可的松 △4–3–酮基

7 肾上腺皮质激素 醋酸地塞米松

8 肾上腺皮质激素 地塞米松磷酸钠

9 雄性激素 甲睾酮

10 雄性激素 丙酸睾酮

11 蛋白同化激素 苯丙酸诺龙

12 C17-甲酮基 孕激素 黄体酮

13 孕激素 醋酸甲地孕酮

14 雌性激素 炔雌醇

15 雌性激素 雌二醇

16 此外 炔诺酮

17 炔诺孕酮 返 回

18 一、结构与性质 1. 肾上腺皮质激素 主要活性基团 性 质 △4–3–酮 UV、与羰基试剂反应 C17–α–醇酮基 还 原 性

19 2. 雄性激素及蛋白同化激素 主要活性基团 性 质 △4–3–酮 UV、与羰基试剂反应 C17–β–羟基 可成酯

20 3. 孕激素 主要活性基团 性 质 △4–3–酮 UV、与羰基试剂反应 C17–甲酮基 与亚硝基铁氰化钠反应

21 4. 雌性激素 主要活性基团 性 质 A环为3–OH 苯环 UV、与重氮苯磺酸盐反应 C17 –乙炔基 与AgNO3反应 C17–羟基
性 质 A环为3–OH 苯环 UV、与重氮苯磺酸盐反应 C17 –乙炔基 与AgNO3反应 C17–羟基 可成酯 返 回

22 二、鉴别试验 1、物理常数测定 熔点－按照Ch.P的熔点测定法进行 第一法：用于测定易粉碎的固体药物 第二法：用于测定不易粉碎的固体药品
第三法：用于测定凡士林及其类似物

23

24 比旋度：不对称物质具有旋光性，当偏振光透过1 dm，样品浓度为1 g/ml的溶液，在一定波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。
吸收系数：在给定的波长、溶剂和温度等条件下，吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸光度。反映了药物的紫外吸收特征

25 2、化学鉴别法 （一）与强酸的呈色反应（母核） H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl 甾体激素类药物 呈色

26 与硫酸显色反应 显 色 荧光 加水稀释 醋酸可的松 黄或微 褪色并澄 带橙 清 炔雌醇 橙红 黄绿 絮状↓玫红 炔雌醚 橙红 黄绿 ↓红色 泼尼松 橙 黄→蓝绿 泼尼松龙 深红 絮状↓灰

27 (二)官能团的反应 1、C17 – α– 醇酮基 还原性 呈色反应 肾上腺皮质激素药物 呈色 四氮唑盐 OHˉ 四氮唑比色法
此外还有斐林试液、多伦试液 肾上腺皮质激素药物 四氮唑盐 OHˉ 呈色 四氮唑比色法

28 2.C3–酮基和C20–酮基 甾酮类激素药物 羰基试剂 腙（黄色） ＃常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼

29 3.甲酮基 具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物 亚硝基铁氰化钠 间二硝基酚 芳香醛 蓝紫色

30 黄体酮 蓝紫色 亚硝基铁 氰化钠 其他甾体 淡橙色或 不显色

31 4.有机卤素 呈蓝紫色 茜素氟蓝 硝酸亚铈 有机氟 Fˉ 有机破坏 有机氯 Clˉ 硝酸—硝酸银 AgCl↓

32 5. 酚羟基 雌激素类药物 重氮苯磺酸 红色偶 氮染料

33 6. 乙炔基的沉淀反应 含炔基的甾体激素 硝酸银 银盐沉淀 ↓

34 (三)制备衍生物测定m.p. 1. 缩氨基脲的生成 2. 酯的水解 苯丙酸诺龙 缩氨基脲衍生物 m.p.约182℃（分解） 丙酸睾酮 睾酮
盐酸氨基脲 苯丙酸诺龙 △ 缩氨基脲衍生物 m.p.约182℃（分解） 2. 酯的水解 丙酸睾酮 碱性条件 睾酮 m.p.为150℃~ 156℃

35 （四）UV法 1. 结构依据 △４-3-酮、苯环、其他共轭结构 280nm左右 240nm左右

36 （五）IR法 炔雌醇 结构特征：酚羟基、C17 –OH C17 –乙炔基

37 ν ν ν 3300cm-1 1615cm-1 1590cm-1 3610cm-1 1505cm-1 3505cm-1 苯环的骨架振动
酚羟基 醇羟基

38 黄体酮 结构特征：△４-3-酮、C17-酮基

39 20位酮基 870cm-1 C=O C-H 1700cm-1 双键 1615cm-1 1665cm-1 3位酮基

40 （六）TLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。

41 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）
（七） HPLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏） 方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。 返 回

42 三、 特殊杂质检查 （一）其他甾体的检查 检查意义：其他甾体与甾体激素药物结 构相似，也有一定的药理作 用而又互不相同.

43 检查方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法）

44 （1）TLC法（高低浓度对比法） 判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色

45 例：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3. 0mg/ml 对照液：供试液（3
例：氢化可的松中其他甾体的检查 供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml 对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60μg/ml 层析：供试液 点样、展开、斑点检出。 对照液 判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜 色与对照液的主斑点比较，不得更深。

46 （2）HPLC法（主成分自身对照法） 判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积

47 （二） 硒的检查 有毒 来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢 方法 氧瓶燃烧 药物 二氨基萘比色法测定 0.005％～0.01％

48 Se的检查 原理 有机药物 氧瓶燃烧 SeO3 硝酸吸收 H2SeO4 羟胺还原 Se4+ 二氨基萘试剂，pH2 4，5苯并苯硒二唑
378 nm 测吸光度 注： 硒标准溶液的配制 溶液的酸碱度 有机酸的安全破坏

49 （三）有机溶剂残留量的检查 以地塞米松磷酸钠为例 GC法 甲醇 ≤ 0.3％ 丙酮 ≤5.0% 内标法 + 校正因子

50 （四）游离磷酸盐的检查 对照品比色法 地塞米松磷酸钠 供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 钼蓝：740nm 对照液：同上
要求：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的吸光度

51 四、含量测定 （一）HPLC法 USP、BP、JP均采用 RP－HPLC（大多内标法）
（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰） 测定对象： 甾体激素类药物的原料和制剂。

52 示例：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相 ODS，流动相 甲醇-水
（65:35），检测波长254nm， 内标物 己烯雌酚 系统适用性试验：n>1000，R符合规定。

53 测定样品：黄体酮原料、注射液。 定量方法：内标法

54 （二）UV法 △４-3-酮 nm（±） 肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素 苯环 nm（±） 雌激素

55 示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查 （1）配制供试液，取10片分别进行测定 （2）测定：240nm （3）计算

56 （三）比色法 （1） 原理 1. 异烟肼比色法 C3－酮基 420 nm 肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素 C - 酮基
异烟腙（黄） 3 HCl （缩合） 420 nm

57 异烟腙（黄色）

58 （2）讨论 反应速度（反应专属性） A. C3=O＞C17= O 、C20= O C11= O 不反应 反应专属性 C3－酮基

59 B. 溶剂的选择 异烟肼盐酸盐→受溶解度的影响 对试剂的稳定性好、呈色强度较无水乙醇中高、但对植物油的溶解度小 无水甲醇 无水乙醇

60 C.水分、温度、O2与光线的影响 含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓ O2与光线对反应的影响不大 t℃ ↑ → ν↑
D. 酸的种类和浓度及异烟肼的浓度 酸：异烟肼=2：1

61 2. 四氮唑比色法 （1）原理 肾上腺皮质激素类 C17-α－醇酮基 强还原性 有色甲瓒 四氮唑盐 [还原] OH - 醇酮基 - a C

62 氯化三苯四氮唑 （TTC） 红四氮唑（RT） [H] 三苯甲瓒↓深红

63 蓝四氮唑（BT）525 nm

64 （2）讨论 A. 基团对反应速度的影响 C11= O＞ C11－OH C21－OH＞ C21-酯

65 B. 溶剂、水分的影响 C. O2与光线的影响 以无醛乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超过5％对结果没有影响 避光
隔绝空气、快速、充N2

66 D. 碱的种类及加入顺序 E. 温度与时间 以氢氧化四甲基铵的结果最佳 加入顺序： 室温（25℃）反应40～45 min 碱试液 四氮唑盐
皮质激素溶液 E. 温度与时间 室温（25℃）反应40～45 min

67 3. Kober反应比色法 雌激素 （1）原理 △ 桃红 黄色 雌激素 2 O H 乙醇 - 4 SO λmax=465 λmax=515

68 雌二醇-3-甲醚 λmax=465 λmax=515

69 [(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚]
铁－酚试剂 Iron-phenol Reagent [(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚] * 铁盐的作用 加快黄色产物的形成、转化 加强红色产物的稳定性 * 酚的作用 加快红色产物的形成 消除反应产生的荧光 返 回

70 五、生物样本中甾体激素的分析 GC-MS:尿样→SPE萃取→衍生化→GC/MS分析 HPLC-MS:血清→ →HPLC/MS分析

71 练习与思考 [A型题] 1. 醋酸地塞米松的鉴别方法是 A.三氯化铁反应 B. 水解反应 C. 柯柏反应
D.与碱性酒石酸铜试液反应 E. 双缩脲反应 2. 丙酸睾酮《中国药典》规定的含量测定方法为 A.非水溶液滴定法 B.溴酸钾法 C.HPLC法 D.紫外分光法 E.旋光法

72 [B型题] A.亚消基铁氰化钠反应 B. Vitali反应 C. Kedde反应 D. 绿奎宁(thalleiaqllin)反应
1. 黄体酮 2. 醋酸地塞米松 3. 地高辛 4. 硫酸奎宁 A E C D

73 [X型题] 1. 用HPLC法测定的药物有 A. 醋酸地塞米松 B. 丙酸睾酮 C. 炔雌醇 D. 硫酸阿托品 E. 黄体酮
2. 可用紫外分光光度法测定含量的药物有 A. 尼可刹米注射剂 B. 醋酸地塞米松片 C. 洋地黄毒苷片 D. 地高辛片 E. 硝酸士的宁注射剂

74 简答题： 1、简述异烟肼比色法测定甾体类激素药物含量的原理及注意事项？ 2、简述四氮唑比色法中的注意事项