第一节 概 述 第二节 脂溶性维生素的测定 第三节 水溶性维生素的测定

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1 第一节 概 述 第二节 脂溶性维生素的测定 第三节 水溶性维生素的测定
食品分析 第九章 维生素的测定 第一节 概 述 第二节 脂溶性维生素的测定 第三节 水溶性维生素的测定

2 第九章 维生素的测定 第一节  概 述 维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症。近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成，大多数维生素都必须由食物供给。

3 第一节  概 述 因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。

4 第一节  概 述 维生素的种类繁多，而且这些有机物的结构也很复杂，有的属于胺类（为B1），有的属于醛类（为B6），有的属于醇类（为A），有一些属于酚或醌类化合物等。目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：一类是能溶在脂肪中的，叫脂溶性微生物素（如A、D、E、K等）；另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。

5 第一节 概 述 维生素B：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。
第一节  概 述 在这二类中与我们最密切，而且了解最多的有： 维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。 维生素B：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。 维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。 维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。 维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。

6 第九章 维生素的测定 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 目前维生素A都是合成的，来源：
第九章 维生素的测定 第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 目前维生素A都是合成的，来源： （1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素） 维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

7 第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。 对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。

8 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 1、维生素A的性质
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 1、维生素A的性质 ⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解； ⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少； ⑶ 对碱稳定。

9 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑴ 样品用有机溶剂萃取脂类
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑴ 样品用有机溶剂萃取脂类 样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。 ⑵脂类的皂化 脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%KOH、无水C2H3OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

10 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑵脂类的皂化 皂化条件：
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑵脂类的皂化 皂化条件： （1）C2H3OH︰脂类 = 8︰1； （2）KOH量 = 脂量×皂化价（mg）×2.5； （3）皂化温度与时间：70℃、30分钟 在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。 ⑶ 提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。

11 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑷ 柱层析分离干扰物质 维生素A与β-胡萝卜素分离：
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 2、测定步骤 ⑷ 柱层析分离干扰物质 采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。 维生素A与β-胡萝卜素分离： 吸附剂：8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱 分离方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；b. 用乙醚洗VA。

12 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法 ⑴ SbCl3比色法
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法 ⑴ SbCl3比色法 维生素A／CHCl3 ＋ SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰 这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。 计算：每百克样品含VA的量= C×（V1/V2）×（100/W） C ：从标准曲线上查得VA的量 V1 ： CHCl3定容的量 V2 ： 测定所取样液体积

13 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法 ⑵ 紫外分光光度法 a. 原理：VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。

14 第二节 脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法 ⑵ 紫外分光光度法 b. 方法
第二节  脂溶性维生素的测定 一、维生素A 3、测定方法 ⑵ 紫外分光光度法 b. 方法 1） 提取及皂化 :称样10.00g → 于烧杯中 → 加40ml水搅匀 → 移250ml分液漏斗中 → 加氨水5ml → 加乙醇35ml → 摇匀 → 用乙醚抽提（每次40ml抽提三次） → 收集乙醚层 → 用10ml水洗乙醚层三次 →水层再用30ml乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚 → 用索氏法除乙醚→ 待瓶中乙醚除尽后 → 加30ml80%的KOH → 40mlC2H5OH →加0.8g焦性没食子酸 → 83℃水浴30分钟（皂化脂肪）→ 冷却后移入250ml分液漏斗中 → 加60ml水 → 用40ml乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性 → 用索氏法除乙醚 → 除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物 → 然后移入刻度试管中

15 第二节 脂溶性维生素的测定 ⑵ 紫外分光光度法 b. 方法 2）层析
第二节  脂溶性维生素的测定 ⑵ 紫外分光光度法 b. 方法 2）层析 在层析柱内装8cm高度中性氧化铝 → 2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠 → 以石油醚浸透 → 装皂化后的样液慢慢于柱内→ 用1～2ml石油醚洗试管 → 洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时 → 加5ml石油醚→ 随后用5ml洗脱液逐次洗涤。 层析柱上第一个黄色层析层，一般是β-胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测β-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中→加0.3ml25%三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。

16 第九章 维生素的测定 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 1、食品中VB1的存在形式 VB1又叫硫胺素
第九章 维生素的测定 第三节  水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 VB1又叫硫胺素 1、食品中VB1的存在形式 ⑴ 常以游离态存在；⑵复合脂形式存在（磷蛋白）；⑶ 辅羧酶形式存在。 VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。

17 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 2、VB1的性质 ⑴ VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；
第三节  水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 2、VB1的性质 ⑴ VB1在中性、碱性下不稳定，易分解； ⑵ VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定； ⑶ VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

18 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定
第三节  水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定 世界各国都用荧光法测定 ⑴ 原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。

19 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定 ⑵ 方法 ① 萃取 ② 水解
第三节  水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定 ⑵ 方法 ① 萃取 100g样品于干燥烧杯中，加入100ml0.1N H2SO4，打成匀浆，煮沸30分钟，称取一定的样品经高压锅121℃、20分钟高压酸解 ② 水解 在酸解的样品中冷却后加入含有10%糖化酶的10ml2.5MNaAC溶液，摇匀，用15%NaOH调PH=4.5，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于50℃恒温箱中12小时

20 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定 ⑵ 方法 ③ 纯化（采用柱层析提纯） ④ 分析
第三节  水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 3、VB1的测定 ⑵ 方法 ③ 纯化（采用柱层析提纯） 吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用25%KCl溶液分数次洗涤，主要是把VB1吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用25%KCl-HAC把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1，再根据上面的原理在碱性下分析。 ④ 分析　 装填柱子（离子交换柱）→ 提纯 → 氧化 → 测定

21 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

22 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

23 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有：
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有： （1）2，6-二氯靛酚法  （还原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法  （总VC） （3）碘酸法 （4）碘量法 （5）荧光分光光度法

24 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 1、原理：还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

25 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂 ⑴ 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000ml； ⑵ 2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml； ⑶ 维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；

26 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂 ⑷ 0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。

27 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 标定一：吸标液（VC）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色。 计算： 抗坏血酸浓度（mg/ml）= （V1 × 0.088）/ V2 V1 - 滴定时消耗0.001N KIO3标液的体积（ml） V2 -维生素C重量（g） ml0.001N KIO3标液≈维生素C的量（mg/ml）

28 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 标定二：吸5ml已知浓度V C标液 → 加5ml1%草酸 → 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点 计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T） T= （C × V1）/  V2 C - 维生素C的浓度（mg/ml） V1 -维生素C的体积（ml） V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml）

29 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 2、试剂 ⑸ 0.001N KIO3标液：吸0.1N KIO3溶液5ml→于500ml容量瓶内→加水至刻度，每毫升相当于VC0.008mg； ⑹ 0.5%淀粉溶液； ⑺ 6%KI溶液。

30 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 3、操作方法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 3、操作方法 ⑴ 提取：称样50g→加2%草酸100ml→到入捣碎机中→处理→过滤→颜色若深可加白陶土 ⑵ 滴定：吸5ml样液→于三角瓶→用染料滴定至粉红色→15秒内不褪色 计算：VC（mg/100g）=（V × T）/ W   × 100 V -消耗染料体积（ml） T -1ml染料所能氧化维生素C的毫克数 W- 滴定时所有滤液中含有样品的克数

31 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 4、注意事项 ⑴ 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 4、注意事项 ⑴ 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水； ⑵ 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考； ⑶ 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C； ⑷ 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；

32 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 4、注意事项
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （一）2，6-二氯靛酚滴定法 4、注意事项 ⑸ 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化； ⑹ 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除； ⑺ 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

33 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC

34 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 1、原理：用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正比，可以比色定量。

35 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑴ 样品处理与分析
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑴ 样品处理与分析 称一定样 → 加等量2%草酸 → 于高速捣碎机捣碎 → 取匀浆20g → 用1%草酸定容100ml → 过滤 → 取滤液10ml → 加1%草酸10ml → 加少量活性炭 → 摇1分钟 → 静置过滤 → 各取滤液2ml于样品管和样品空白管 → 各管加入1滴硫脲溶液 → 于样品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml → 分别于两个管加盖 →

36 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑴ 样品处理与分析
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑴ 样品处理与分析 于37℃保温箱3小时 → 取出后样品管放入冰水中 → 样品空白管取出后冷至室温 → 在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼 → 0.5ml → 样品管和空白管都于冰浴中 → 滴加85%H2SO42ml于各管中 → 边滴边摇 → 防止温度升高炭化后呈黑色 → 冰浴中30分钟后取出 → 室温下放置30分钟后，在540nm测消光值，从标准曲线上查出相应的含量

37 第三节 水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑵ 标准曲线的绘制
第三节  水溶性维生素的测定 二、维生素C的测定 （二）2，4-二硝基苯肼法 2、步骤 ⑵ 标准曲线的绘制 取5个50ml容量瓶编号       2     3     4     5 加VC标准液     20    30    40    50ml 取5个比色管取相应      2     2     2     2     2 加硫脲溶液（滴）            1     1     1     1 2，4-二硝基苯肼（ml）    0.5    0.5   0.5    0.5      于37℃保温箱3～4小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分钟→在540nm下测各消光值绘标准曲线，同时做空白。 计算：每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W *100

38 第九章 维生素的测定 思考题： 1.大多数维生素定量方法中，维生素必须先从食品中提取出来，通常使用哪些方法提取维生素？对于一水溶性维生素和一脂溶性维生素，分别给出一个适当的提取方法。 2.在生产和储备食品过程中，L-抗坏血酸能被氧化成L-脱氢抗坏血酸。你如何用2，6-二氯酚靛酚滴定法来测定总的维生素C含量，以及如何分别测定这两种形式。