第十章 维生素分析 CHARTER 10 Vitamin Analysis

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1 第十章 维生素分析 CHARTER 10 Vitamin Analysis
10.1 概述 10.2 水溶性维生素的分析 10.3 脂溶性维生素的分析

2 10.1 概 述    维生素是一类维持人体生命正常活动所需的有机化合物，是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。人体主要从膳食中摄入维生素（一般不能自行合成或量不足）。当摄入量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时，就会引起各种维生素缺乏症而患病，如坏血病（缺乏维生素C）、癞皮病（缺乏尼克酸）。大多数维生素都必须由食物供给，因此，维生素作为强化剂已在食品工业的某些产品中开始使用，测定食品中的维生素含量，不仅可评价食品的营养价值，同时还起到监督维生素强化食品的剂量，以防摄入过多的维生素而引起中毒，所以，测定食品中维生素在营养分析方面具有重要的意义。另外，通过测定维生素含量，可以指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症；也可以研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制定合理的工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素。

3 维生素特点 维生素结构多样性、复杂性、含量低，
理化性质及生理功能各异，有的属于醇类或胺类，有的属于醛类，还有的属于酚或醌类化合物。它们有以下共性： 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在； 它们不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小； 它们—般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取，长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病，是食品添加剂的一部分； 食品中各种维生素的含量主要取决于食品的品种；还与食品的工艺及贮存等条件有关，许多维生素对光、热、氧、pH值敏感。

4 各种常见的维生素

5 维生素的命名通常按发现历史时间，以英文字母顺序排列。目前已发现的维生素约有二、三十种，按维生素溶解性能可将它们分成两大类：
水溶性维生素（如B1（硫胺素）、B2 （核黄素） 、B3 （烟酸） 、 B5 （泛酸） 、B6 （吡哆素） 、B7 （生物素）、 B9 （叶酸）、B12（钴胺素）、维生素C等）。植物性食物中常以辅酶的形式存在。 脂溶性维生素（如A（A1、A2）、D（D2、 D3）、E（-、-、-、-等8种）、K（K1、K2）等）。在食物中，与脂类共存。

6 维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。
维生素B1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。 维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。 维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。 维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。 

7 常用的分析方法 ☆ HPLC-UV/FD； ☆ 光谱法（可见光比色法、紫外吸收光谱法）； ☆ 微生物或生物分析方法。
维生素的定量分析特点是食品中含量低且容易分解，前处理复杂。分析技术进步依次是生物法、光谱法、色谱法到色质联用分析法。从测定单一维生素到可同时测定多种维生素。 维生素检测最早方法是生物法。用雉鸡生长发育来评价维生素含量，优点是不需详尽分离组分，能准确测定维生素生物效能。 方法费时长（21天），不易于重复也不准确，已淘汰。目前常见的维生素分析方法可归纳以下3种：

8 微生物法：根据某种维生素是某种细菌生长所必需的原理，以细菌繁殖程度或代谢产物定量该维生素含量，方法选择性较高，多用于水溶性维生素检测，适用于检测多种衍生物的总和（如总叶酸），是经典方法。但微生物法操作繁琐、耗时过长，而且要求有特殊设备和专门的训练人员。 光谱法：比色法（可见分光光度计、紫外分光光度计）；荧光法，利用维生素本身具有的荧光性，或经过反应后产生荧光物质，在激发波长和发射波长条件下检测，如B1、B2。这两种方法灵敏、快速，有较好的选择性。 色谱法（HPLC法等 ）：利用维生素在固定相、流动相之间分配比的差异进行分离。可用于脂溶性维生素、水溶性维生素分析。HPLC 可一次检测多种衍生物或维生素，速度快，已经成为主流的分析方法。

9 国家主要标准分析方法 标准分析方法有些陈旧，应更新 GB/T 5009.82-2003 食品中维生素A和维生素E的测定
GB/T 食品中硫胺素（维生素B1）的测定 GB/T 食品中核黄素的测定 GB/T 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法） GB/T 食品中维生素B6的测定 GB/T 蔬菜中维生素K1的测定 GB/T 保健食品中维生素B12的测定 标准分析方法有些陈旧，应更新

10 样品的前处理 水溶性维生素：VB1，VB2可能与蛋白质，淀粉等结合在一起，一般可通过酸水解或酶水解使其游离出来，然后进行提取，纯化和测定。
脂溶性维生素：样品 → 皂化 → 脂溶性维生素和皂化物 → 过滤 → 有机溶剂抽提 → 浓缩 → 溶于适当溶剂 → 测定。

11 10.2 水溶性维生素的分析 维生素B1的测定 VB1又称硫胺素。食品中VB1常以游离态、复合脂形式存在（磷蛋白）、辅羧酶形式存在。 VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。 VB1为白色结晶，微溶于乙醇，不溶于乙醚或氯仿，易溶于水。VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；

12 依据GB/T 5009.84-2003 食品中硫胺素（维生素B1）的测定--荧光法
原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外光照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素含量成正比。即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。

13 维生素C的测定 维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。 维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2,3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

14 测定维生素C常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法等。
靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质(如Fe+2、Sn+2、Cu+2等)会干扰测定，使测定值偏高。对深色样液滴定终点不易辨别。 苯肼比色法和荧光法测得的都是抗坏血酸和脱氢坑坏血酸的总量。苯肼比色法操作复杂，特异性较差，易受共存物质的影响，结果中包括二酮古乐糖酸，测定值偏高。 荧光法受干扰较小，且结果不包括二酮古乐糖酸，准确度较高，重现性好，灵敏度与苯肼比色法基本相同，操作较复杂。 高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的测定方法。

15 2,6-二氯靛酚滴定法 原理：还原型抗坏血酸还原染料2,6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2,6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。 在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2,6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

16 注意事项 ⑴ 所有试剂的配制最好都用二级水； ⑵ 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；
⑴ 所有试剂的配制最好都用二级水； ⑵ 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考； ⑶ 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C； ⑷ 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低价铁离子（Fe2+），要用8%的乙酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2,6-二氯靛酚，使测定数值增高，使用乙酸可以避免这种情况的发生； ⑸ 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化； ⑹ 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除； ⑺ 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

17 GB/T 5009.86-2003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法）
可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2,4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC。 GB/T 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法）

18 GB/T 5009.86-2003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法）
原理：试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹唔啉( quinoxaline)，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。 GB/T 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2,4-二硝基苯肼法）

19 高效液相色谱法

20 由于HPLC的高选择性与灵敏度，因而应用HPLC法分析食品中维生素C是目前最为常用的方法，它可以克服食品中其他化合物的干扰。
对乳制品的脱蛋白，可采用稀的高氯酸溶液(0.05mol／L)。在样品前处理过程中，防止L-抗坏血酸的氧化是非常重要的，可采用添加偏磷酸溶液的方法加以解决。

21 10.3 脂溶性维生素的分析 维生素A的测定 维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含维生素A，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。

22 维生素A是由-紫罗酮环与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物总称，包括A1和A2。维生素A1即视黄醇；维生素A2即3-脱氢视黄醇，是视黄醇（维生素A1）衍生物之一，它也有多种异构体 ，维生素A1还有许多种衍生物，包括视黄醛、视黄酸、3-脱氢视黄醛、3-脱氢视黄酸及其各类异构体，它们也都具有维生素A的作用，总称为类视黄素。其化学结构式如下：

23 维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、高效液相色谱法。
三氯化锑比色法适用于样品中含维生素A高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10g维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不能应用比色法测定。 对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含维生素A低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。

24 三氯化锑光度法 原理：在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑作用可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其蓝色的深浅与维生素A的含量在一定范围内成正比，故可通过吸光度测定维生素A的含量。 注意：维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。 生成的蓝色络合物的稳定性差，比色测定必须在6秒钟内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀．因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。

25 此标准无法将 -生育酚与 -生育酚分离开
高效液相色谱法（GB/T ） 高效液相色谱条件(推荐条件) 色谱柱：ultrasphere ODS ； 流动相：甲醇 : 水＝98 : 2； 流速：1.7 mL／min 紫外检测器：300nm ； 进样量：20L。 此标准无法将 -生育酚与 -生育酚分离开

26 维生素E的测定 维生素E（Vitamin E）是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即、、、生育酚和、、、三烯生育酚，  -生育酚是自然界中分布最广泛含量最丰富活性最高的维生素E形式。 采用高效液相色谱法、气相色谱法测定。

27 1 -生育酚；2 -生育酚；3 -生育酚；4--生育酚
高效液相色谱法 高效液相色谱条件(推荐条件) 正相分析柱：SUPELCOSIL LC-SI； 流动相：己烷 : 乙醚＝97 : 3； 流速：1.2 mL／min 荧光检测器： ex 290 nm、  em 330 nm ； 进样量：10L。 1 -生育酚；2 -生育酚；3 -生育酚；4--生育酚

28 复习思考题 简述食品中维生素的测定方法及特点。 测定脂溶性维生素时样品需如何处理？ 测定水溶性维生素时，从样品中提取浓缩可采用哪些方法？
简述采用HPLC测定维生素A、维生素E的原理。 简述维生素C的测定方法及其原理。